细胞生物学研究方法3.ppt

本文档共70页；当前第31页；编辑于星期二\5点27分 2）负染技术 P60 用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸出的地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。 Negative Stained Actin 本文档共70页；当前第32页；编辑于星期二\5点27分 3）冰冻蚀刻 freeze-etching P60 亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。 A Yeast Cell 本文档共70页；当前第33页；编辑于星期二\5点27分 20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。 分辨力为6~10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。 （二）扫描电子显微镜SEM P62 本文档共70页；当前第34页；编辑于星期二\5点27分 Scanning electron microscope（ SEM） 本文档共70页；当前第35页；编辑于星期二\5点27分 工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。 本文档共70页；当前第36页；编辑于星期二\5点27分 扫描电子显微镜原理 本文档共70页；当前第37页；编辑于星期二\5点27分 人类红细胞 本文档共70页；当前第38页；编辑于星期二\5点27分 酵母 本文档共70页；当前第39页；编辑于星期二\5点27分 人类精子 本文档共70页；当前第40页；编辑于星期二\5点27分 （三）扫描隧道显微镜 P63scanning tunneling microscope，STM 原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。 分辨率：横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm。 用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。 本文档共70页；当前第41页；编辑于星期二\5点27分 扫描隧道显微镜原理 本文档共70页；当前第42页；编辑于星期二\5点27分 STM image, Benzene molecules accumulate at step edges on Cu 本文档共70页；当前第43页；编辑于星期二\5点27分 三、显微操作技术micromanipulation technique 在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。 显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。 细胞核移植技术已有几十年的历史，Gordon等人（1962）对非洲爪蟾进行核移植获得成功。我国著名学者童第周等上个世纪70年代在鱼类细胞核移植方面进行了许多工作，并取得了丰硕成果。 本文档共70页；当前第44页；编辑于星期二\5点27分 显微操作仪 本文档共70页；当前第45页；编辑于星期二\5点27分 第二节 生物化学与分子生物学技术 一、细胞化学技术 本文档共70页；当前第46页；编辑于星期二\5点27分 组织化学和细胞化学染色方法（histochemical and cytochemical staining method）用于对某些细胞成分进行定性和定位研究。 （一）固定 物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。 化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。 本文档共70页；当前第47页；编辑于星期二\5点27分 （二）显示方法 金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。 Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。 联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 茚三酮反应：显示蛋白质。 本文档共70页；当前第48页；编辑