鸡胚成纤维细胞T7噬菌体文库的构建.docxVIP

工程学等领域，发展成为一门重要的生物技术，并取得顯著成就。T7噬菌体是裂解性噬菌体，在细胞质中完成组装后，成熟的噬菌体直接通过细胞裂解而释放。不像丝状噬菌体系统，展示在T7表面的多肽或蛋白质不需要通过细胞膜分泌出来，因而其表面展示多肽和蛋白的范围广。另外，T7噬菌体生长迅速、复制速度快、克隆效率高以及稳定的特性，使之成为替代其他传统系统的更好选择。为此，我们拟构建鸡胚成纤维细胞T7噬菌体表达文库，以期从中筛选出不同病毒的相关受体，为进一步研究鸡胚成纤维细胞蛋白相互作用提供了实验研究平台。 一、材料与方法 1.试验材料 T7Select10-1b? Cloning Kit （Novagen公司），鸡胚成纤维细胞cDNA：由本实验室制备和保存。 2.鸡胚成纤维细胞cDNA与T7受体臂的连接 在无菌的1.5mL管中混合cDNA片段与T7受体臂，然后轻轻地用移液器枪头上下吹打混匀，于16℃孵育12～16h。贮存于4℃，备用。 3.鸡胚成纤维细胞T7噬菌体文库的体外包装 向以解冻的25μL T7选择性包装提取物中加入5μL连接反应产物，室温孵育2h后，再加入270μL无菌LB液体培养基，终止反应。 4.鸡胚成纤维细胞T7噬菌体原始文库的测定 5.鸡胚成纤维细胞T7噬菌体文库的扩增及滴度的测定 本实验选用平板法对文库进行扩增。首先将过夜培养的宿主菌按2%的接种量接种50 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600=0.6～1.0，贮存于4℃，备用。最后通过噬菌斑测定扩增后文库的滴度（同原始文库滴度测定）。 6.鸡胚成纤维细胞T7噬菌体文库的序列测定 取上述随机挑选的10个阳性克隆噬菌斑PCR产物，送至上海生物技术服务有限公司测序。测序结果NCBI进行比对，鉴定其与鸡基因全序列的同源性。 二、结果与分析 1.鸡胚成纤维细胞cDNA T7噬菌体原始文库的滴度 鸡胚成纤维细胞体噬菌体原始文库在倍比稀释度为10-3时的噬菌斑个数约100（图1），在稀释度为10-4时的噬菌斑个数为11（图2），代入公式：稀释倍数×10×板上噬菌斑的数量，计算得鸡胚成纤维细胞T7 噬菌体原始文库的滴度为1.1×106pfu/ mL。 2.鸡胚成纤维细胞T7噬菌体文库的重组子鉴定 随机挑选10个噬菌斑，用 T7seleetUP/DOWN引物进行PCR检测重组子比例，重组子为6个，占60%，即鸡胚成纤维细胞cDNA文库重组率为60%。 3.鸡胚成纤维细胞T7噬菌体文库扩增后的滴度 扩增后的鸡胚成纤维细胞T7噬菌体文库稀释度为10-7时的噬菌斑个数约为200，在稀释度为10-8时的噬菌斑个数为18，经计算得扩增后的鸡胚成纤维细胞T7噬菌体文库滴度为1.8 ×1010 pfu/mL。 三、讨论