荧光免疫标记技术.pptxVIP

 荧光免疫标记技术; 免疫标记（immunolabelling technic） 是指用一些易测定的、具有高度敏感性的标记物质：荧光素、放射性核素、酶、胶体金、生物素、铁蛋白及化学（或生物）发光剂等作为追踪物，标记特异性的抗原、抗体分子进行的抗原、抗体反应。 通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原、抗体的性质与含量。并借助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器对试验结果直接镜检观察或进行自动化测定。 可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上对抗原、抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法对体液中的半抗原、抗原进行定性和定量测定。 具有高度敏感性、特异性、快速性。; 免疫标记技术主要分为： 免疫荧光技术： 放射免疫测定：自动化仪器价格昂贵、所用试剂半衰期短、危及人体健康 酶免疫技术：敏感、快速、简便、应用范围广、不需特殊设备;免疫标记技术的应用 标记物与抗原、抗体的连接技术； 标记后的抗原、抗体进行特异性检测的实验设计原理以及相应的检测仪器的使用方法。;免疫荧光标记技术（immunofluorescence technique） 是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位，检测出抗原或抗体。; 免疫荧光标记技术 始创于20世纪40年代初，1942年Coons等首次报道用异氰酸荧光素标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。当时由于异氰酸荧光素标记物的性能较差，未能推广使用。直至1958年Riggs等合成了性能较为优良的异硫氰酸荧光黄（fluorescein isothiocyanate，FITC）。Marshall等又对荧光抗体标记的方法进行了改进，从而使免疫荧光技术逐渐推广应用。; ; ;荧光寿命---荧光物质被瞬时光脉冲激发后产生的荧光衰减到一定程度所用时间。 荧光淬灭---荧光物质的荧光辐射能力在受到激发光较长时间的照射后发生的减弱现象。 淬灭剂---苯胺、硝基苯、酚等 荧光（标记）物质的保存; 用于标记的抗体：高特异性和高亲和力 作为标记的荧光素应符合以下要求： 应具有能迅速而稳定地与蛋白质分子形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。 荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。 有强的荧光效应，即使标记后也不出现非特异染色荧光色泽,与背景组织的色泽对比鲜明。容易与自发荧光及其他荧光相区别（如双重标记时） 与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。 尽可能少褪色 标记方法简单、安全无毒。 与蛋白质的结合物稳定，易于保存 有良好的水溶性，溶解后不与其它物质发生化学反应， 纯净，可用标准试剂检验。;常用的荧光标记试剂: 荧光素类 ：标准荧光素及其衍生物 异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC） 羟基荧光素（carboxyfluorescein,FAM） 四氯荧光素（tetrachlorofluorescein,TET） 罗丹明类（Rhodamine dye) 标准荧光素的衍生物 四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC） 四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）;异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC） 外观：为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。 分子式：C21H11NO5S 分子量为 389.4 纯度：≥95% (HPLC) 最大吸收光波长为490-495nm，最大发射光波长520-530nm，呈现明亮的黄绿色荧光， 有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。 主要优点： ①人眼对黄绿色较为敏感， ②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 ; ;四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC） 最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm 呈橙红色荧光 与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色 其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低 ;四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200） 橘红色粉末 不溶于水，易溶于酒精和丙酮 性质稳定，可长期保存 最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595-600nm 呈橘红色荧光;荧光FITC+RB200标记;荧光素FITC标记抗体;FITC标记方法： 搅拌法： 适用于标记体积较大、蛋白质含量较高的抗体溶液。优点是标记