菊花中主要活性成分含量测定及其抗氧化活性研究.docxVIP

菊花中主要活性成分含量测定及其抗氧化活性研究 作为一种常见的药物饮食，菊花含有多种维生素、无机碱和次生代谢产物，对治疗和疗效有一定的影响。菊花的主要活性成分为黄酮类和酚类化合物,由于菊花品种、产地、甚至采摘期不同,菊花中的主要活性成分的种类和含量都有差异。目前文献报道的菊花黄酮主要有:香叶木素、木犀草素、芹菜素、槲皮素、香叶木素-7-葡萄糖苷、木犀草素-7-葡萄糖苷、芹菜素-7-葡萄糖苷、金合欢素半乳糖苷等;多酚类化合物主要为绿原酸。 自由基是机体氧化反应产生的有害化合物,具有强氧化性。在生理情况下自由基不断产生,也不断被清除,其浓度保持着动态平衡,但是过量的自由基对机体有损伤效应,与炎症、肿瘤等疾病有关联。大量的研究表明,植物中黄酮类化合物具有清除自由基的能力,其可通过直接消除自由基发挥抗氧化活性,从而减轻自由基对细胞和组织的损伤。 本研究采用恒温浸提结合加热回流法对菊花中主要活性物质进行提取纯化,通过高效液相色谱法(HPLC)检测菊花中含量较高的几种成分,为进一步研究主要成分的功效提供一定的依据;同时测定菊花样品中总黄酮的含量,以及总氧化能力、清除羟自由基能力和DPPH自由基清除率,观察三者之间的关系。 1 材料和方法 1.1 抗氧化活性测定 贡菊(安徽黄山)、杭白菊(浙江桐乡)、亳菊(安徽亳州)、滁菊(安徽滁州)、杭白菊黄酮提取物上海善力健生物科技有限公司。 芦丁标准品(MUST、绿原酸(MUST、木犀草苷(MUST、木犀草素(MUST、槲皮素(MUST、芹菜素(MUST(纯度均≥98%)南京奥多福尼生物公司;总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒、羟自由基测定试剂盒南京建成生物工程研究所;DPPH自由基美国Sigma公司;甲醇、乙腈(色谱纯);其他试剂为分析纯。 1.2 电子天平万分之一 RE52CS旋转蒸发器、SHZ-III型循环水真空泵上海亚荣生化仪器厂;电子天平(万分之一)德国Sartorius公司;粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司;恒温烘箱、752型紫外分光光度计、电热恒温水浴锅PK-S22上海精宏设备公司;NKA-9大孔树脂上海摩速公司。 1.3 方法 1.3.1 流动相的测定 选用Diamonsil C18色谱柱(4.6mm×150mm,5uf06dm)。绿原酸、木犀草苷测定的流动相A为乙腈,流动相B为体积分数0.5%冰醋酸水溶液,按表1程序进行梯度洗脱,槲皮素、木犀草素、芹菜素测定的流动相A为甲醇,流动相B为体积分数0.5%冰醋酸水溶液,按表2程序进行梯度洗脱,流速均为0.8m L/min,柱温30℃,检测波长350nm,进样20uf06dL。理论板数按各待测成分计算均不低于2000,绿原酸、木犀草苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素与其他组分峰的分离度均大于1.5。 1.3.2 uf06dg/dm纤维过滤 精密称取各待测成分标准品5.00mg,分别置10m L容量瓶中加入甲醇溶解后定容,摇匀即得500uf06dg/m L标准品储备液,0.22uf06dm微孔滤膜滤过待用。 1.3.3 nga-4-孔树叶片提取 将菊花样品置于烘箱中干燥,继而粉碎后过50目筛。精密称取菊花样品1.0000g,加入一定量60%乙醇60℃水浴提取4h,抽滤取滤渣,加热回流提取2h,合并提取液,旋转蒸发浓缩至10m L左右,提取液过NKA-9大孔树脂色谱柱,蒸馏水淋洗,75%乙醇洗脱,收集洗脱液,浓缩烘干。取适量菊花提取物用甲醇定容至50m L,0.22uf06dm微孔滤膜滤过,待测其主要成分的含量。另取上述制备的菊花提取物(贡菊、杭白菊)粉末适量,配制质量浓度为1.0mg/m L的待测液;菊花对照为市场上可以购得的杭白菊黄酮提取物,用乙醇配成待测液进行总黄酮含量及抗氧化活性的测定。 1.3.4 线性回归ld50 精确移取绿原酸对照品贮备液1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 m L分别定容至1.0 m L,精确移取木犀草苷、槲皮素、木犀草素和芹菜素贮备液0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125m L分别定容至1.0m L,取各稀释溶液20uf06dL进样,以峰面积(Y)和含量(X)进行线性回归。 1.3.5 标准曲线的绘制 精确称取干燥至质量恒定的芦丁标准品10.0mg,置于50m L容量瓶,加60%乙醇稀释至刻度,摇匀,即得0.2g/L标准品对照液。精密吸取对照液0、1、2、3、4、5m L,分别置10m L量瓶中,各加60%乙醇溶液至7m L,精密加入0.3m L 5%Na NO2,摇匀,静置6min,加入0.3m L 10%Al(NO3)3溶液,摇匀,静置6min,最后加4%Na OH溶液,摇匀,乙醇