第十章核酸的生物合成.ppt

一种PCR反应体系 　　　　　　 10×扩增缓冲液 　 10ul 　　　　　　 4种dNTP混合物 　 各200μmol/L 　　　　　　 引物 　　　　 　 各10～100pmol　 　　　　　　 模板DNA 　　　 　 0.1～2μg　 　 　　　　　Taq DNA聚合酶 　 2.5u　 　　　　　　 Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L 　　　　　　 加双或三蒸水至 　 100μl 本文档共72页；当前第31页；编辑于星期三\14点42分 94 ℃，预变性5分钟 94 ℃，变性1分钟 55 ℃，退火1分钟 72 ℃，延伸1分钟 最后一次72 ℃，延伸5分钟 30个循环 一种PCR反应程序设计 本文档共72页；当前第32页；编辑于星期三\14点42分 生物因素、物化因素均可导致DNA的损伤 1.?物理因素 ????紫外线、?电离辐射、αβγX-射线等 2.?化学因素 ?? 烷化剂、?碱基或核苷类似物、亚硝酸盐及亚硝 胺、?代谢活化化合物（苯并笓、黄曲霉毒素等） 以上物理及化学因素统称诱变剂。 3.??生物因素 ?DNA、RNA肿瘤病毒可插入基因组，引起突变。 ?复制时的碱基错配，互变异构、碱基脱氨、碱基丢失。 本文档共72页；当前第33页；编辑于星期三\14点42分 DNA的损伤修复 主要有五种修复系统： 错配复活（mismatch repair) 直接修复（direct repair) 切除修复（excision repair） 重组修复（recombination repair） 易错修复（error-prone repair） 本文档共72页；当前第34页；编辑于星期三\14点42分 错配复活 (Mismatch Repair) 原核细胞内存在Dam甲基化酶，能使5`GATC中A的N6位甲基化。 复制后DNA在短期内（数分钟）为半甲基化的GATC序列。 细胞错配系统能区别新链与旧链。 MutS二聚体与其识别结合，两向移动形成突环至GATC。 核酸内切酶（MutH）从未甲基化的GATC5’端开切，重新合成（DNA聚合酶） 本文档共72页；当前第35页；编辑于星期三\14点42分 本文档共72页；当前第36页；编辑于星期三\14点42分 直接修复（Direct Repair) 光复活酶可被可见光激活，分解UV照射形成的嘧啶二聚体。 O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶能去除O6上的甲基，恢复正常的鸟嘌呤。 UV 本文档共72页；当前第37页；编辑于星期三\14点42分 O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶去除O6上的甲基 本文档共72页；当前第38页；编辑于星期三\14点42分 切除修复（Excision Repair） 是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-polⅠ和连接酶完成。 多种特异的核酸内切酶，识别DNA损伤部位，在其附近将DNA单链切开，再由外切酶将损伤链切除，由聚合酶以完整链为模板进行修复合成，最后有连接酶封口。 本文档共72页；当前第39页；编辑于星期三\14点42分 本文档共72页；当前第40页；编辑于星期三\14点42分 重组修复——稀释错误 此过程也叫复制后修复。 重组修复中原损伤没有除去，若干代后可逐渐稀释。 所需要的酶包括与重组及修复合成有关的酶。 本文档共72页；当前第41页；编辑于星期三\14点42分 易错修复（Error-Prone Repair） SOS反应：是细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的应急效应。 紫外线照射过的E.Coli较未照射过的E.Coli，接受紫外线照射过的λ噬菌体感染时存活率高。 SOS反应诱导的修复系统包括避免差错修复(error free repair)和易产生差错修复. 本文档共72页；当前第42页；编辑于星期三\14点42分 逆转录（Reverse Transcription) 以RNA为模板, 指导DNA合成的过程称为逆转录，由逆转录酶催化进行。 1964年Temin提出前病毒假设。 1970年Temin和Baltimore同时分别从(鸡)劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致癌RNA病毒中分离出反转录酶 1975年，二人获得诺贝尔奖 本文档共72页；当前第43页；编辑于星期三\14点42分 RNA 模板 逆转录酶 DNA-RNA 杂化双链 RNA酶 单链DNA 逆转录酶 双链DNA 逆转录病毒的复制 本文档共72页；当前第44页；编辑于星期三\14点42分 逆转录酶的酶学性质 逆转录酶是多功能酶，兼有3种酶的活性： RNA指导