项目3:革兰染色法教案.docx

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项目3:革兰染色法 【目的要求】 掌握细菌涂片标本的制作及革兰染色法。 【实验内容】 细菌微小、无色半透明、未经染色而单用显微镜放大,仅能粗略地看到其大小和形态;欲观察清楚,必须进行染色。染色后还能认识细菌的各种不同结构,并可协助鉴别细菌。 染色方法有单染法和复染法。前者应用一种染料使细菌着色,用以观察细菌的大小、形态和 排列;后者用两种或两种以上的染料,有助于鉴别细菌,故又称鉴别细菌染色法。革兰染色法为最常用的染色法。 一、细菌涂片的制作 要进行细菌染色,首先需制作细菌涂片,制片的一般过程分涂片、干燥和固定三个步骤。 【材 料】 普通琼脂平板菌落或斜面培养物,生理盐水,载玻片,接种环、酒精灯等。 【方 法】 涂片:在玻片上加少量生理盐水,用接种环取细菌培养物少许,在生理盐水中混匀,并涂布一层薄膜,取材勿过多,以免涂片太厚。如用液体培养物,不需加生理盐水,有菌的接种环应 立即在酒精灯火焰上烧灼灭菌。 干燥:涂片置室温自然干燥,也可在酒精灯弱火处略烘使干,切勿用高温烘烤。 固定:将干燥的涂片面向上在酒精灯火焰上来回通过三次,直至手背试触涂片反面略有烫感为限。固定的目的是杀死细菌并使菌体与玻片粘附较牢,以免染色时被染料和水冲掉。 二、革兰(Gram)染色法 革兰氏染色法(Gram’s stain)是最常用的细菌染色法,本实验要求同学能正确掌握此染色方法的操作技术,理解其在鉴别细菌上的重要意义。 【原理】 细菌经结晶紫初染染成蓝色。革兰氏染色阳性菌(G+)细胞壁肽聚糖层数多,且肽聚糖为空 间网状结构,再经乙醇脱水,网状结构更为致密,染料复合物不易从细胞内漏出,仍为蓝色。而革兰氏染色阴性菌(G—)细胞壁脂类含量多,肽聚糖层数少,且肽聚糖为平面片层结构,易被乙醇溶解,使细胞壁通透性增高,结合的染料复合物容易泄漏,细菌被脱色为无色,再经石炭酸复 红稀释液复染成红色。 【材料】 ① 金黄色葡萄球菌 24h 斜面培养物 ② 大肠埃希菌 24h 肉汤培养物 ③ 革兰氏染色液:结晶紫染液、碘液、95%酒精、稀释石炭酸复红液 ④ 生理盐水 ⑤ 载物玻片、接种环、显微镜、镜油、擦镜纸等。 【方法】 按涂片→干燥→固定→染色→镜检的顺序进行。准备载物玻片:用镊子从载物片缸中取出经 3%盐酸酒精脱脂的载物玻片,用擦片布擦净,然后用特种铅笔在玻片背面画一个直径为1.5~2.0cm 的圆圈,做为涂膜的标记范围。 点燃煤气灯:先把煤气灯的煤气孔和通气孔闭上,再把管道的煤气开关打开,然后把煤气灯的煤气口稍稍开放,立即用火柴点燃之,适当调节煤气孔和通气孔,使火焰长度在 8~10cm,并能分清内外焰为止。 涂片:按无菌操作取材法进行,具体步骤如下: 用肉汤培养物涂片: ① 右手拿接种环的黑色塑料柄部分,左手托持试管。 ② 将接种环按 15°角放在酒精灯的外焰中烧灼灭菌,直到把金属丝烧红(图 1—2),然后将铝制的银色柄部也通过火焰略加烧灼。 ③ 用右手小指和手掌的前内缘拔掉左手所持试管的棉塞,并立即将试管口用火焰烧灼灭菌。 ④ 用灭菌后已冷却的接种环伸入试管中取出材料(图 1—3),此时注意勿使沾有材料的接种环触碰试管壁及试管口。 ⑤ 将试管口再次灭菌,棉塞也要在火焰上略加烧灼(时间要短以免点燃棉塞),塞好棉塞,放回原处。 ⑥ 将接种环上之材料涂于载物片上,随后立即将接种环用火焰烧灼灭菌。为防止细菌溅散污染环境,接种环灭菌前,须先将接种环靠近火焰或放内焰中烤干,然后再在外焰中烧红灭菌,杀死残留的细菌。 用斜面培养物涂片: 用细菌斜面培养物涂片,需预先取一接种环生理盐水放在载物片上,然后再按无菌操作取材法从斜面培养物上取少量菌苔,在水滴内轻轻研磨将细菌制成菌悬液,再涂成一薄膜。无菌操作取材步骤同前。 干燥:放空气中自然干燥。如欲加速,也可把涂片置于火焰上部的热气层中烘烤,但切勿将涂膜烤焦。 固定:用染色夹子夹住涂片,在火焰的最热部分连续通过三次,以固定之。此时杀死大部分细菌,并使标本固定于玻片上,以免在染色或水洗过程中被冲掉。 染色: ①将结晶紫染液加于涂膜上,染色(初染)1min。 ②水洗后加卢戈氏碘液处理(媒染)1min。 ③水洗后用 95%酒精脱色,脱色时频频摇动玻片,直至流下的液体无色为止(约需 0.5min)。 ④水洗后加石炭酸复红稀释液染色(复染)0.5min。 ⑤水洗,用滤纸轻轻吸干,待标本充分干燥后进行镜检。 染色过程中,水洗要用自来水的细流徐徐冲洗,冲洗涂膜的背面,勿使强水流直接冲到涂膜 上。 【结果观察】 使用油镜观察,注意标本中两种细菌的形态、大小、排列各如何,最后判定染色性,哪种细菌是革兰氏阳性菌(染成紫色),哪种细菌是革兰氏阴性菌(染成红色)。 将在标本中观察到的细菌形态和染色性,用有色铅笔画出模式图,并附以文字说明。 注意事项:①酒精脱色是

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