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uplc鉴别紫草中萘类化合物及质谱裂解规律研究 中药紫草源于紫草科植物新疆紫草（软紫草）arnima（royle）约翰斯，紫草（硬紫草）etzec或蒙古紫草的干燥根具有清热、活血、解毒、皮疹等功效。主要产于新疆、云南、内蒙古、西藏等地。软紫草和硬紫草是中药紫草的主要来源。紫草具有抗肿瘤、抗炎、保肝护肝等多种药理活性。 紫草萘醌为紫草主要的活性成分之一。紫草萘醌类化合物包括紫草素(shikonin)、乙酰紫草素(acetylshikonin),β,β′-二甲基丙烯酰紫草素(β,β′-dimethylacrylshikonin)、异丁酰紫草素(isobutylshikonin)、β-羟基异戊酰紫草素(β-hydroxyisovalerylshikonin)等等。紫草中萘醌类化合物的含量测定方法多采用HPLC检测,分析时间长,检测成本高。本研究应用液相色谱-飞行时间串联质谱鉴别紫草中的化学成分,根据已知对照品、化合物的准分子离子信息,结合紫外光谱、色谱行为以及参考文献对紫草中的萘醌类化合物进行指认,现报道如下。 1 仪器、试药与仪器 Waters Acquity UPLC(Ultra-Performance Liquid Chromatography)超高效液相色谱系统,配有在线脱气机、二元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器;美国ABI公司QSTAR XL型液相色谱串联飞行时间质谱仪;超声波清洗仪:Branson8510,功率:40k Hz;十万分之一电子分析天平;甲醇和乙腈购自Fisher公司,均为色谱级;其余试剂均为分析纯;超纯水经过Milli-Q系统纯化制备。 紫草药材于药材主产地及各大药材集散地收集,由本院药剂科冯倩茹副主任药师鉴定均为新疆紫草(软紫草)Arnebia euchroma(Royle)Johnst。紫草素(批号:110769-200405)和β,β′-二甲基丙烯酰紫草素(批号:111689-200502)购自中国药品生物制品检定所,乙酰紫草素购自上海同田生物技术股份有限公司,批号:10949-2001,纯度均大于98%。 2 方法和结果 2.1 流动相、运行时间、流速 色谱柱:Agilent SB-C18柱(2.1×50 mm,1.8μm);流动相:A为0.1%甲酸水溶液,B为乙腈,等度洗脱,A与B体积比为35∶65;运行时间:7 min;流速:0.3 m L·min-1;进样量5μL;柱温为35℃;检测波长274 nm。色谱分离图见图1。 2.2 gas1:33 液相条件同2.1项下,ESI源,负离子检测;IS:-4.0 k V;GAS1:35;GAS2:35;CUR:25;TEM:350℃;DP:-30 V;FP:-150 V;DP2:-10 V;CEM:-2.2 KV;TOF扫描质量范围m/z 50-500。 2.3 对照品溶液的制备 取紫草素、乙酰紫草素和β,β′-二甲基丙烯酰紫草素对照品适量,精密称定,分别置于5 m L量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,制得含1 mg·m L-1的对照品溶液。 2.4 供试品溶液制备 紫草60℃干燥12 h后,粉碎,过4号筛,称取0.2 g置于具塞锥形瓶中,精密称定。精密加入40 m L石油醚(60~90℃),称重,超声提取30 min,待冷却至室温后,补重,滤过,精密量取20 m L挥干,残渣甲醇超声溶解于5 m L量瓶中,稀释至刻度,0.22μm的微孔滤膜滤过,取续滤液,作为供试品溶液。 2.5 准分子离子质谱 为了获取紫草药材UPLC色谱图中各主峰的化学结构信息,本研究采用液相色谱串联飞行时间质谱对样品进行了分析。根据已有的对照品、化合物的准分子离子及其主要的裂解碎片,结合紫外光谱、色谱保留时间等信息共指认了5个色谱峰的化学归属,分析和指认的结果见表1。 峰1为紫草素,在负离子模式下,其准分子离子质荷比(m/z)为287,二级质谱可见m/z为218的基峰,是准分子离子([M-H]-)发生丙烯基裂解脱去异戊烯基(C5H9)所得。峰2为乙酰紫草素,其准分子离子([M-H]-)m/z为329,二级质谱可见m/z为270的基峰,来源于准分子离子脱去乙酰氧基,m/z 269为失去一分子乙酸所得碎片。峰3为异丁酰紫草素,其准分子离子([M-H]-)m/z为357,二级质谱也可见m/z为269和270的碎片,是准分子离子分别脱去异丁酰氧基和异丁酸所得,碎片m/z 87即为异丁酰氧基碎片。峰4为β,β′-二甲基丙烯酰紫草素([M-H]-,m/z 369),二级质谱可见脱去异戊烯酰氧基和异戊烯酸而得的m/z为269和270的碎片及异戊烯酰氧基(m/z 99)碎片。峰5为异戊酰紫草素([M-H]-,m/z 371),二级质谱亦见m/z 269,270和101碎片。五种萘醌类成分的二级子