单克隆抗体的制备方法医学文章.docxVIP

ristane(降植烷)或液体石蜡于BALB/C ristane(降植烷)或液体石蜡于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细 p↓3周后加强免疫（融合前三天）1×107/0.5mlip或iv↓取脾融合细胞融合1．细胞融合前准备 抗体。但此方法产量低，一般培养液内抗体含量为10～60μg/ml,如果大量生产，费用较高。（2）体内 养细胞。在制备McAb的过程中，许多环节需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中， 动物的选择与免疫 1．动物的选择 纯种 BALB/C 小鼠， 较温顺， 离窝的活动范围小，体弱， 食量与排污较小， 一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种 BALA/C 小鼠。 2．免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的 McAb 至关 重要。 一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫， 免疫方案应根据抗原的特 性不同而定。 （ 1 ）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。 常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原 1～ 50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般 0.8 ～ 1ml,0.2ml/ 点） ↓3 周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或 ip（腹腔内注射）（ip 剂量不宜超过 0.5ml ） ↓3 周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂， ip（5 ～ 7 天后采血测其效价） ↓2 ～ 3 周 加强免疫，剂量 50 ～ 500μg为宜，ip 或 iv（静脉内注射） ↓3 天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可 溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性， 另一方面可降低抗原的使用量。 ②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。 ③使用细胞因子作为佐剂， 提高机 体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免 疫时要求抗原量为 1～ 2 ×107 个细胞。 初次免疫 1 ×107/0.5ml ip ↓2 ～ 3 周后 第二次免疫 1 ×107/0.5ml ip ↓3 周后 加强免疫（融合前三天） 1 ×107/0.5ml ip 或 iv ↓ 取脾融合 细胞融合 1．细胞融合前准备 （ 1）骨髓瘤细胞系的选择： 骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率 高， 也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量 McAb 。常用的骨髓瘤细胞系见表 2-4。 表 2-4用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系 Ig Ig 链 名称 来源 耐受药物 H L 两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。在用HAT选择培养 两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后 失等等。如果没有原始细胞的冻存，则可因上述意外而前功尽弃。杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法 ，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μ。l一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。⑦将培养板置 ℃预热）在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。（5）混匀后立倾注于琼脂基底层上，在室温中10 P3/X63-Ag8(X63) P3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653) P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1) P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul) SP2/0-Ag14(SP2/0) F0 GM15006TG-A12 U-266AR BALB/C 骨 髓 瘤 MOPC-21 P3/X63-Ag8 P3/X63-Ag8 （X63×BALB/C 脾 细胞）杂交瘤 （X63×BALB/C 脾 细胞）杂交瘤 BALB/C 骨髓瘤 P3/X63-Ag8 BALB/C 骨 髓 瘤 MPC-11 LOU 大 鼠 骨髓瘤 R210 人骨髓瘤 GM1500 人骨髓瘤 U-266 8-氮鸟嘌呤 8-氮鸟嘌呤 8-氮鸟嘌呤 8-氮鸟嘌呤 8-氮鸟嘌呤 8-氮鸟嘌呤 5-溴脱氧尿嘧啶核 苷 6-巯鸟嘌呤 8-氮鸟嘌呤 6-巯鸟嘌呤 8-氮鸟嘌呤 r1 K －－ － K （不分泌型） －－ －－ －－ －－ r2b K － K r1 K ελ 骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如 RPMI1640 ，DMEM 培养基。小牛血清的浓 度一般在 10% ～ 20%，细胞浓度以 104 ～ 5×105/ml 为宜，最大浓度不得超过 106/ml 。当细胞 处于对数生长的中期时，可按 1：