分子生物学载体课件.pptxVIP

;载体的功能;理想载体至少必备的条件;目前的主要载体;5;大肠杆菌的质粒;;质粒DNA的空间构型;质粒空间构型与电泳速率 分子量相同的，scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。;1.1 质粒的生物学基本特性;;质粒的不相容性分子机制;;;1.2 质粒的类型;1.2 质粒的类型;1.3 质粒的命名;;;;（4） 插入失活型质粒载体 载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。;;;如何阅读质粒图谱;如何阅读质粒图谱;如何阅读质粒图谱;;;克隆位点：10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’ 基因的5’端。 选择标记：Ampicillin 抗性和 lacZ 的 α 肽互补（蓝 白斑）相结合。;5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖;31;32;33;34;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷;36;37;38;39;;T4 Bacteriophage;;;;;iiiiii));;2.3.2 M13 噬菌体;;;RF-DNA(复制型DNA) ? +DNA转译与包装相关的蛋白质 RFDNA达到200个拷贝时, +DNA被单链特异的DNA结合蛋白结合,阻断-DNA的复制只能以-DNA为模板复制新的+DNA 新的+DNA立即被积累在细胞内的壳蛋白包装成新的噬菌体;M13 DNA载体的构建：;M13系列载体的优点;λ 噬菌体的生物学特性： 生物结构 λ 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体 λ 噬菌体由外壳包装蛋白和λ-DNA组成 λ-DNA为线状双链DNA分子，全长48502个核苷酸，两端各有一个12核苷酸的互补单链，称为 cos区。 λ-DNAλ-DNA上至少有61个基因，左边是外壳蛋白的基因，右边是负责裂解宿主细胞，DNA自主复制以及调控基因，中间是负责与宿主染色体 DNA遗传重组整合的基因。;λDNA进入细菌体内后，可形成双链环状DNA复制型 （RF DNA）。;;57;58;;60;2.4.3 λ噬菌体载体的构建;插入型载体长度36.4kb 插入片断长度：0-14.5kb（36.4-51.9kb〕;;64;65;替换型λ-DNA载体长度26kb 插入片断长度：10.4-24.9kb（36.4-51.9kb〕;;2.4.5 λ载体的体外包装 λ-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了λ噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分： 一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组λ-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组λ-DNA???染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。;λ载体的体外包装;体外包装存在的问题 ① 包装错误：既能包装内源性原λDNA，也能包装重组的 λDNA载体。 ? 重组：外源的重组λDNA载体被诱发与内源性原λDNA发生重组。 ③ 体外包装的容量限制：必须在正常野生型容量的75% ~105% （36—51kb）之间，即既不能超过正常野生型容量的105%；又不能低于正常野生型容量的75%。 注：野生型λDNA的必须区是28kb，所以λ载体的最大克隆容量是23kb。（一般为15kb）。;;2.4.6λ-DNA及其重组分子的分离纯化;2.4.7λ-DNA载体的优点;3 cosmid载体（粘粒）;;;考斯质粒的构建;cosmid vector的特点;人类和哺乳动物的基因组很大，甚至许多 单个基因也相当大（如：DMD gene 2300kb） ，克隆分析就需要更大的基因载体。如近年来构建的一些载体：BAC，PI，YAC等。;将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制 区、分配区、稳定区与质粒组装在一起， 即可构成染色体载体。当大片段的外源 DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 目前常用的人造染色体载体包括： 细菌人造染色体（BAC）酵母人造染色体（YAC）;优点：能携带大片段DNA，约300kb。 在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，高产DNA。 缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克隆DNA部分的缺失或重排。为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制子载体，如，E coli中的F因子。此质粒含有2种基因（part A, part B）。每个E;细菌人造染色体 （Bacterial Artificial Chromosomes BAC）;酵母人造染色体 （Yeast Artificial Chromosomes YAC）;酵母人工染色体（YAC）;YAC 的主要功能成份有三：;YAC酵母人工染色体;噬菌体PI载体和PAC;表