第6章目的基因的分离克隆(植物基因工程)课件.pptxVIP

第六章 目的基因的分离克隆 . 1 基因工程的步骤 . 2 p目的基因 l 把需要研究的基因称为目的基因 l 为使优良性状聚集于同一生物体， 在生物群体中分离编码蛋白的结构基因， 并在此基础上创造出有价值的新物种。 l 生物界的长期进化积累了大量对人 类有用的基因，这是一个宝贵的资源。 . 3 第一节 克隆的概念 克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。 u名词：无性繁殖系 u动词：形成DNA分子、细胞或个体的无 性繁殖系的过程 u形容词：克隆的 u载体 . 4 植物转化 . 5 幼苗克隆 组织培养 . 6 . 7 第二节 目的基因的克隆方法 1 、转录水平的克隆 2 、基因组水平上的克隆 3 、蛋白质组水平的克隆 . 8 1、转录水平的克隆 (1) 相关概念及cDNA文库 l基因的差别表达:生物个体发育的 不同阶段、或在不同的组织器官中、 或在不同的环境条件下发生的不同 基因按一定时间和空间有序表达的 方式称为基因的差别表达。 9 . lcDNA文库 (Complementary DNA library) 以组织细胞中的mRNA为模板，反 转录合成双链cDNA ，各cDNA分子 分别插入载体形成重组子，再导入 宿主细胞克隆扩增。这些在重组体 内的cDNA的集合即cDNA文库。 . 10 cDNA文库的构建步骤 分为六个阶段： 阶段1： mRNA反转录酶催化合成cDNA第一链 阶段2：cDNA第二链的合成 阶段3：cDNA的甲基化 阶段4：接头或衔接子的连接 阶段5：纯化cDNA 阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接 . 11 以mRNA为模板，经反 转录酶合成互补DNA (cDNA) ，构建的基因库。 令绝大多数真核生物 mRNA的3′端具有一段多 聚A(poly-A)尾端序列。在 反转录酶作用下，用poly- T引物(primer)，引导合成 一条互补DNA，即第一条 DNA链，形成RNA-DNA 杂合双链。然后合成第2 条链。 ncDNA文库筛选的优点 lcDNA文库仅包含正在表达的基因 l不同物种、不同组织的cDNA文库不相同 l基因总量少，易筛选 令 . 12 . 13 . 14 (2) 如何从cDNA文库中找到所需要的基因？ . 15 转录水平上的基因克隆方法 l 差别杂交筛选 l 扣除杂交 l 代表性差别分析 l 差异显示 l cDNA阵列杂交 l 基因表达系列分析 l 抑制差减杂交 . 16 用对照样品cDNA作探 针杂交的X光片中没有 而在检测样品cDNA作 探针杂交的X光片中有 的印斑，可对照X光片 从原平板挑出菌落进行 鉴定是否含有目的基因 Ø差别杂交筛选 转膜 cDNA文库 铺平板 不含有表 达目的基因 含有表达 目的基因 比较 分析 转膜 . 17 . 18 经过柱或其他方 法去掉双链杂合体 来源相似 而功能有 异的两种 样品 cDNA文库 富集目的基因 构建扣除cDNA 筛选目的基因 Ø扣除杂交 反转录为 cDNA 检测方 mRNA . 19 n差别显示技术 . 20 n根据生物大分子间的相互作用分离 目的cDNA克隆 酵母双杂合系统 真核生物的位点特异转录激活因子： BD AD . 21 . 22 n基于EST信息的基因克隆 EST . 23 由杨树EST库获得基因序列 PCNA . 24 克隆的核酸酶 . 25 . 26 2、基因组水平上的克隆 将所有的遗传物质克隆到细菌中----DNA文库 基因组文库(gene library) ：将某种生物的基因组DNA切割成 一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进 行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合， 即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。 令通常的方法是，尽量提取 大分子量的核DNA，用限制 性酶酶切后，分离选择具有 一定长度(大于15kb)的DNA 片段，与适宜的载体连接构 成重组DNA分子, 选择相应 的宿主细胞用于克隆。载体 可以是质粒，噬菌体， BAC 或YAC等 . 27 DNA片段与载体重组 筛选目的基因(核酸探针法、免疫结合法) 鸟枪法制备DNA片段 抽提基因组DNA 文库构建流程 转化宿主菌 . 28 . 29 令例:人类基因组3.0x106kb, 以λEMBL作载体， 插入片段的平均长度为17kb ，p为99%时, 基因 库应有8.1x105 个 重组噬菌体。 30 ◆理想的核基因库应当能包括全部的基因组序 列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则总 克隆数目少，常选择能接受较大片段的载体。 令检测是否包括一个完整的基因组序列的公式： . cDNA或寡