微生物分子生态学研究方法详解演示文稿.pptVIP

原理 双链DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA 片段能够被区分开，但同样长度的DNA 片段在胶中的迁移行为一样，不能被区分。 DGGE/TGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度或是温度梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA 片段区分开来。 一个特定的DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域(melting domain, MD)和解链行为(melting behavior) 。 一个几百个碱基对的DNA 片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成。当变性剂浓度逐渐增加各区域依次发生解链。 本文档共51页；当前第30页；编辑于星期二\1点37分 显示的是一个234bp 长的DNA 片段的解链区域，横坐标是该DNA 片段的序列，依次从第一个碱基到第234 个碱基；纵坐标是解链温度。该DNA 片段共有3 个解链区域。 MD1 是解链温度最低的一个解链区域，MD3 是温度最高的一个解链区域。 本文档共51页；当前第31页；编辑于星期二\1点37分 不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。 当它们进行DGGE时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA 片段最低的解链区域解链，此时DNA 片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。 一旦DNA 片段迁移到一定位置，其变性剂浓度使双链DNA 片段最低的解链区域解链，部分解链的DNA 片段在胶中的迁移速率会急剧降低。因此，不同的DNA 片段会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。 本文档共51页；当前第32页；编辑于星期二\1点37分 然而，当变性剂浓度达到DNA 片段最高的解链区域温度时，DNA 片段会完全解链，此时它们又能在胶中继续迁移，这些片段就不能被区分开来。 在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夹子，一般30-50 个碱基对）可以解决这个问题。 含有GC 夹子的DNA 片段解链温度很高，可以防止DNA 片段在DGGE 胶中完全解链。 当加了GC 夹子后，DNA 片段中每个碱基处的序列差异都能被区分开。 本文档共51页；当前第33页；编辑于星期二\1点37分 本文档共51页；当前第34页；编辑于星期二\1点37分 当用DGGE/TGGE 技术来研究微生物群落结构时，要结合PCR（polymerase chain reaction）扩增技术，用PCR 扩增的16S rDNA 产物来反映微生物群落结构组成。 通常根据16S rRNA 基因中比较保守的碱基序列设计通用引物，其中一个引物的5’-端含有一段GC 夹子，用来扩增微生物群落基因组总DNA，扩增产物用于DGGE/TGGE 分析。 由于DGGE/TGGE一般只能分析500 bp 以下的DNA片断，所以一般选择扩增16S rRNA基因的V3区或V6-V8区。 本文档共51页；当前第35页；编辑于星期二\1点37分 40% 60% Denaturant C A B C B A Denaturing Gradient Gel Electrophoresis PCR 11f 1512r 1392r 968fgc 16S rDNA 本文档共51页；当前第36页；编辑于星期二\1点37分 微生物分子生态学研究方法详解演示文稿 本文档共51页；当前第1页；编辑于星期二\1点37分 （优选）微生物分子生态学研究方法 本文档共51页；当前第2页；编辑于星期二\1点37分 20世纪70年代以前：传统的培养分离方法，依靠形态学、培养特征、生理生化特性的比较进行分类鉴定和计数，认识是不全面和有选择性的，方法的分辨水平低。 微生物群落结构和多样性研究方法： 在70和80年代：对微生物化学成分的分析，建立了一些微生物分类和定量的方法（生物标记物方法），对环境微生物群落结构及多样性的认识进入到较客观的层次上。 在80和90年代：现代分子生物学技术以DNA为目标物，通过rRNA基因测序技术和基因指纹图谱等方法，比较精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性，并给出了关于群落结构的直观信息。 本文档共51页；当前第3页；编辑于星期二\1点37分 虽然可以检测环境中的活细胞，并且对微生物生态学的发展起了很重要的作用。 采用配比简单的营养基质和固定的培养温度，还忽略了气候变化和生物相互作用的影响，这种人工环境与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少 （不到1 % ）。 Amann 等人报道在自然环境样品中可培养的微生物占总的微生物数量的比例范围从0.001%（海水）到0.3%（土壤）。