高三 工程技术复习课程（精品、经典）.pptx

专题5 基因工程技术 ——PCR和电泳 关于构建基因表达载体：选择限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体，再用DNA连接酶进行连接，形成基因表达载体。选择同种限制酶切割——产生相同的黏性末端，方便连接。 容易出现目的基因片段环化、载体环化、反向连接。限制酶切割位点——启动子和终止子之间、不破坏标记基因 关于筛选导入目的基因的受体细胞利用标记基因的作用，筛选导入载体的受体细胞。（因此选择的限制酶不能切割标记基因，至少保留一个）可能导入的是空白载体。 蓝白斑筛选3.某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因（ AmpR ), LacZ 基因（其编码产生的 β﹣半乳糖苷酶可以分解 X - gal 产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色；否则菌落为白色）及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如下图所示。达标检测 (4）步骤⑤中呈 色的菌落含有重组质粒，原因是 。重组质粒的 LacZ 基因被破坏，不能编码产生β﹣半乳糖苷酶来分解 X - gal 而使菌落呈白色白 一、PCR技术原理:DNA半保留复制特异性两种引物Taq酶（热稳定DNA聚合酶）酶双链DNA4种dNTP模板和原料一定的缓冲溶液温控设备其他条件 PCR的应用有哪些？1、扩增目的基因2、检测某种基因 3、基因编辑 思考：根据下图判断需要知道目的基因的哪一端核苷酸序列？引物Ⅰ3’端5’端5’端3’端引物的3’端DNA聚合酶DNA母链新合成的DNA子链根据目的基因的3’端的部分核苷酸序列合成引物 关于PCR引物设计原则扩增特异性扩增高效性引物①引物长度要适宜，通常为20-30个核苷酸②引物GC含量要适宜，一般为45-55%③退火温度要适宜④引物自身及引物之间不应存在互补序列 DNA双链模板引物4种脱氧核苷酸变性退火延伸循环94℃55℃72℃三、PCR技术的过程思考：根据上图在第几次PCR循环过程中出现等长的DNA？第3次 PCR产物的鉴定：琼脂糖凝胶电泳技术电泳的原理是什么？电泳：DNA分子在电场作用下发生迁移,越小的DNA片段距离出发点越远。 （四）DNA的电泳鉴定微量取液器 1 2 3 4 5 61.Marker：标准大小的DNA分子2：目的基因3-5：不同循环次数的PCR产物6：清水开展电泳鉴定实验时，采用凝胶成像仪或紫外线投射仪观察和记录结果 六、PCR的应用（一）（实时）荧光定量PCR（（r）RT-PCR）rRT-PCR可以分两部分来看，其中r代表实时（real-time），主要是通过荧光PCR连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量，该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。 ；RT表示逆转录（reverse transcription）。在RT-PCR中，通过逆转录酶将RNA转化为cDNA，然后通过聚合酶链式反应扩增cDNA（图1）。2019-nCoV 核酸检测 优点：早期诊断、灵敏度和特异性高，判断是否感染新冠病毒的直接接证据。 下图显示了相关原理：在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小。 定点突变技术是指通过聚合酶链式反应（PCR）向目的基因片段中引入所需变化。GFP（绿色荧光蛋白）的发光基团是第 65 至 67 位的三个氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸），该发光基团可利用定点突变技术使第66位酪氨酸换成组氨酸，即可发出更明亮的蓝光，成为蓝色荧光蛋白（图4）。定点突变第一步得把突变位点设计在引物上，据图中信息人工合成短 DNA 引物应包含的序列是 。AGAGTGCTC 经典的大引物PCR定点诱变技术成为基于PCR的定点诱变技术中应用最普遍的方法,操作过程如图甲。利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR(PCR1和PCR2),在PCR1中,至少需要　　个循环才能获得相应的大引物模板。在PCR2中,要获得带有突变位点的改良基因,引物应选用大引物两条链中的　　　　　(填“①”或“②”)。 2 ②