枯草杆菌摇瓶发酵生产α淀粉酶.pptVIP

三、实验内容 微生物发酵法是酶制剂生产的主要方法。发酵生产中多用液体深层发酵法制备酶。 大规模液体深层发酵之前，首先在实验室对保藏的目的菌种进行活化和扩大培养，制得生产种子。 扩大培养多采用摇瓶培养，即在锥形瓶中加入一定量的液体培养基，在摇床上以一定转速摇动进行恒温培养。 摇瓶培养也是实验室模拟生产上进行发酵产酶的一种模拟实验。（摇瓶发酵生产α-淀粉酶） 发酵液酶活力的测定。 本文档共43页；当前第30页；编辑于星期二\16点18分 （一）摇瓶发酵产酶 仪器和试剂 1、菌种：枯草芽孢杆菌 2、仪器耗材：恒温培养箱、冰箱、高压灭菌锅、无菌操作台、摇床、托盘天平、分析天平、电炉、白色搪瓷杯、三角瓶、量筒、纱布、绳子、pH 试纸、玻棒等。 本文档共43页；当前第31页；编辑于星期二\16点18分 一、实验目的 掌握酶的发酵生产方式之——微生物发酵产酶； 学习和掌握摇瓶培养的方法。 本文档共43页；当前第1页；编辑于星期二\16点18分 二、实验原理 酶可由动物（如胰蛋白酶、胃蛋白酶）、植物（如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶）和微生物（细菌、霉菌、酵母）产生，其中工业酶制剂大多数由微生物发酵法生产。 由于微生物世代时间短，繁殖快、容易培养和管理，可大规模工业化生产，所以工业酶制剂大多由微生物发酵产生。 产酶微生物的获得： 1、从有关菌种保藏机构购买 2、从自然界分离筛选 本文档共43页；当前第2页；编辑于星期二\16点18分 产酶微生物的分离筛选方法 1)样品的采集：从富含酶作用底物的场所采集样品。 2)富集培养: 投其所好，取其所抗。 3)分离获得纯培养(pure culture)的微生物。 4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。 5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。 本文档共43页；当前第3页；编辑于星期二\16点18分 产酶工艺条件及其调节控制 保藏细胞 细胞活化 细胞扩大培养 发酵产酶 分离纯化 酶 固定化细胞 原生质体 固定化原生质体 培养基 预培养 无菌空气 本文档共43页；当前第4页；编辑于星期二\16点18分 酶制剂的发酵生产过程图解 本文档共43页；当前第5页；编辑于星期二\16点18分 30升全自动发酵罐 本文档共43页；当前第6页；编辑于星期二\16点18分 本文档共43页；当前第7页；编辑于星期二\16点18分 本文档共43页；当前第8页；编辑于星期二\16点18分 发酵工艺参数的控制 pH的调节控制 温度的调节控制 溶解氧的调节控制 泡沫的控制 染菌的控制 本文档共43页；当前第9页；编辑于星期二\16点18分 酶的提取与分离纯化的工艺流程 发酵液 预处理（细菌絮凝） 固液分离（离心、过滤） 菌体（胞内酶） 动植物源酶 液体（胞外酶） 细胞破碎 提取 固液分离 液体 本文档共43页；当前第10页；编辑于星期二\16点18分 工业、食品、饲料 浓缩 （蒸发、超滤、沉淀） 浓缩液 配方 干燥 医药、分析、科研 液体酶 固体酶 浓缩 分离纯化 （离心、沉淀、膜分离、 层析、电泳、萃取、结晶） 配方、制剂 干燥 液体酶 固体酶 本文档共43页；当前第11页；编辑于星期二\16点18分 酶活力的测定 酶活力： 也称酶活性，酶催化一定化学反应的能力。 酶活力大小可用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的起始速率V0表示，即用反应起始阶段产物增加(或底物减少)的速率表示。 v = -dS/dt =dP/dt 本文档共43页；当前第12页；编辑于星期二\16点18分 酶活力测定方法 酶活力测定的要求：快速、简便、准确。 包括两个阶段： 1、将酶与反应底物混合均匀，在一定条件下反应一段时间； 2、测定反应液中底物或产物的变化量。 本文档共43页；当前第13页；编辑于星期二\16点18分 酶活力测定的基本步骤： (1) 根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。 (2) 根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH值、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。 (3) 在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。 (4) 反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。 注意：若不能即时测出结果的，则要及时终止反应，然后再测定。 本文档共43页；当前第14页；编辑于星期二\16点18分 终止酶反应的方法： 加热使酶失活； 加入适宜的酶变性剂（如三氯醋酸）； 调节pH值； 低温终止反应。 本文档共43页；当前第15页；编辑于星期二\16点18分 酶活力测定方法 根据测量操作过程 终止反应法：在恒温反应系统中进行酶促反应，间隔一定时间取