异硫氰酸荧光素FITC.docx

异硫氧酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC) FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体I型在效率、 稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490?495nm,最大 发射光波长为520?530nm,呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广 泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 FITC是一种常用的绿色荧光探针。FITC的吸收(激发)和发射峰参见下表。 Fluorophore Absorption Peak(nm) Emission Peak(nm) FITC 492 520 当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键 (thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖 氨酸残基，一般最多能结合15?20个，一个IgG分子可结合2?8个分子的FITC，其反应式如下 FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质 一 FITC-NS-C-N-H2-蛋白质 常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963) 的透析标记法。 Marsshall 法 材料抗体球蛋白溶液、0. 5mol / L(pH9. 0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氤酸荧光素、 1 %硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4?冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7. 2或3. 0的0. 01mol /LPBS 等。 方法及步骤 ①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加入生理盐水及碳酸 盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为20mg/ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将烧瓴置 电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5?10min。 荧光素的准备 根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0. 01mg荧光色素，用分析天 平准确称取所需的异硫氤酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出 需加缓冲液的量。 蛋白溶液：含量Amg/m1；容积Bml。 总蛋白量(AXB)=Crag。 C/20?C/10 = Dmg(如蛋白含量低于20mg/ml,用 C/10；如高于20mg / ml,用 C/20) 荧光素 FITC 的量：(1/50?2/100)XC=Emg。 巳 0. 5mol / L(pH9. 5)碳酸盐缓冲液 D/10 = Fml。 PBS 量 D-(B+F)=Gml。 注：A为蛋白含量，mg/ml； B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg； D为常数，mg；正为 荧光素的量，mg； F为碳酸盐缓冲液的容积，ml； G为PBS的容积，ml。 结合(或标记)边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大 约在5—10min内加完)，加完后，继续避光搅拌12h左右。结合期间应保持蛋白溶液于4。。左右，故需 将烧杯和搅拌器一起移人4。。冰箱中。 透析结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心2500r/min)20rain，除去其中少量的沉淀物，装入 透析袋中，再置于烧杯中，用pH8. 0缓冲盐水透析(0?4~C)过夜。 过柱取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G—50柱，分离游离荧光素，收 集标记的荧光抗体进行鉴定。洗脱液：0. 01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7. 2)；过滤量：12ml标记全球蛋 白液(过滤前未透析)；收集量：20ml(稀释1. 7倍左右)。 Chadwick 法 试剂和材料 抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%碳酸钠水溶液、0. 01mol/L pH8.0PBS、 1%硫柳汞、离心机及离心管、烧杯(25ml)搅拌器、无菌吸管，无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500ml) 透析袋等。 方法及步骤 ①抗体准备 用。?4~C的pH8。0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为 30?40mg/ml,置入25ml烧杯内，放于冰槽中。 荧光色素准备 按每毫克免疫球蛋白加入荧光素0. 01rug计算，称取所需的荧光素，用3%碳酸 钠水溶液溶解。 将准备的抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在。?4~C冰箱中结合(最好在磁力搅拌机上 持续搅拌)18?24h。 透析和柱层析方法同Marsshall法。 改良法 试剂和材料 ①0.01mol / L(pH7.2)PBS 配法中，校定 pH 至 7.2。NaCi 18g、Na2HP04 1. 15g， 溶于2000ml蒸馏水 0. 5mol / L(pH9. 0)碳酸盐缓冲液配法 取 0.