16srrna基因pcr方法鉴定乳酸杆菌及嗜热链球菌.docxVIP

16srrna基因pcr方法鉴定乳酸杆菌及嗜热链球菌 近年来，新食品资源的开发导致新形式的细菌增多，其安全性也越来越受到重视。由于益生菌对人体的作用具有株的特异性,即同种不同株的益生菌其作用是不同的,即使是传统认为安全的益生菌菌种也不能保证种内所有菌株均安全,一些投产时认为安全的优良菌种,其遗传特性在长期的保存过程中也会发生变化甚至遗传标记的丧失,由此导致其固有良好性能的丢失。鉴于目前食品生产中使用益生菌种类的多样性,来源的多渠道,可用于生产食品类别和形式的广泛性,食用人群的敏感性等,使益生菌的安全状况越来越受到公众的关注,因此对益生菌的正确鉴定是保证其产品食用安全性的重要基础。 益生菌的分类鉴定技术一直是国内外研究的课题之一。根据大体形态、显微镜下特征、生化反应等进行益生菌分类与鉴定是目前国内普遍使用的方法,该方法虽然直观、无需特殊仪器,但鉴定周期长、时效性差、样品前处理繁琐。近年来,具有简单、快速、准确等特点的聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术被广泛用于微生物研究中,为细菌r RNA的分析提供了区别于传统细菌分类鉴定系统的新分类方法。16 S r RNA PCR克隆测序方法是基于细菌DNA上16 S r RNA序列的一种基因鉴定方法,而建立的基于细菌16S r RNA基因序列的数据库(如GENBANK和核糖体数据库等),使得测序结果的比对更加可靠。因此以16S r RNA/DNA为基础的分子生物学技术正日益成为微生物种群分析和鉴定的重要手段。本研究建立了乳酸杆菌和嗜热链球菌种水平鉴定的16 S r RNA PCR克隆测序方法。 1 材料和方法 1.1 培养基和试剂 1.1.1标准菌株干酪乳酸杆菌干酪亚种(Lactobacillius casei subsp casei)1.2435、德氏乳酸杆菌保加利亚亚种(Lactobacillius delbrueckii subsp bulgaricus)1.2161、植物乳酸杆菌(Lactobacillius plantanum)1.2158、嗜酸乳酸杆菌(Lactobacilliusacidophilus)1.2686,上述菌株均购自中国科学院微生物研究所。 1.1.2实验菌株北京市售酸奶中分离的乳酸杆菌及嗜热链球菌共计50株。 1.1.3培养基MRS培养基和MH培养基(Becton Dickinson公司);SOB培养基:分别称取胰蛋白胨20 g、酵母提取物5g于1000ml锥形瓶中,加入适量蒸馏水并加热溶化,加入5mol/L Na Cl 2ml、3mol/L KCl 0.83 ml,并补充蒸馏水至1000 ml,分装后121℃高压灭菌15 min备用。SOC培养基:灭菌后的SOB肉汤培养基临用前每100ml加入1mol/L无菌葡萄糖溶液2ml而成。Terrific培养基:分别称取酪蛋白胰酶消化物12g、酵母提取物24g、磷酸二氢钾9.4g、磷酸氢二钾2.2g于1000ml锥形瓶中,加入适量蒸馏水并加热溶化,补充蒸馏水至1000ml,分装后121℃高压灭菌15min备用。 1.1.4试剂溴化乙锭(EB,美国Sigma公司);DNA Marker(北京奇华盛生物技术发展中心);胰蛋白胨、酵母提取物、酪蛋白胰酶消化物(英国OXOID公司);丙三醇(北京北化精细化学品有限责任公司);氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾(北京化学试剂公司);氨苄青霉素(Serva公司);IPTG、X-Gal、p UC18-T、DNTP、DNA提取试剂盒(日本Ta Ka Ra公司);Quant-ItTmds DNA HS Assay Kits(Invitrogen公司);氯化镁、Taq DNA聚合酶、10×Taq缓冲液(FERMENTAS公司);M13通用引物(Ta Ka Ra公司);琼脂糖(北京欣经科生物技术有限公司);PCR纯化试剂盒(BIO BASIC公司)。 1.1.5仪器恒温培养箱[(4±1)~(50±1)℃,日本SANYO公司],厌氧装置(法国Biomerieux公司),离心机(德国BECKMAN公司),电泳装置、凝胶成像系统和PCR仪(BIO-RAD公司),电热恒温水浴箱(10~100℃,北京医疗设备厂),电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。 1.2 pcr扩增及纯化 1.2.1乳酸杆菌及嗜热链球菌DNA提取方法优化从冻存管内取出少量乳酸杆菌及嗜热链球菌酸奶分离株菌液,划线接种于MRS琼脂培养基平皿,(36±1)℃厌氧培养48h后,无菌接种环挑取单个菌落接种于盛有无菌MRS肉汤的试管内,(36±1)℃厌氧增菌培养24h,取1.5ml增菌液于2ml离心管中,3000×g离心10min,弃上清,底部菌体分别用水煮法及D