动物干细胞培养技术.pptVIP

染色体联会复合体的分析 （3）分化能力检测 体外分化实验　 将所得细胞制成悬液培养在培养皿中，如所得细胞为ESC，则在培养过程中部分细胞聚集贴壁，培养一段时间后将分化为神经、肌肉、软骨等不同组织细胞，同时还有部分细胞悬浮生长，先形成简单类胚体，进一步形成囊状胚体。根据ES细胞分化程度不同，可初步了解其分化能力的强弱 体内分化实验　 以一定量所得细胞腹股沟接种或腹腔注射到同源动物或免疫缺陷小鼠体内,若为ESC，经过一段时间后，动物注射处可见有组织瘤生成。手术取瘤，常规制作切片观察，可见代表内胚层、中胚层和外胚层３个胚层的不同组织细胞。 体外分化实验 体内分化实验 （4）嵌合体的形成 利用囊胚注射法，应用显微注射仪将ES细胞注射到受体囊胚腔，使其与正常胚胎结合在一起，再移植到假孕母鼠子宫腔（胚胎移植），使之发育成个体。 如果ES细胞具嵌合能力，则会融合到宿主胚胎细胞中，并共同分化发育成各种组织细胞，并产生嵌合体小鼠，嵌合体动物可以通过皮毛颜色、蛋白质、DNA 指纹、同工酶等进行检测。 而ES细胞一旦分化即丧失全能性，便难以参与胚胎发育形成嵌合体。 NT ES Tetra-clone Differentiation Donor （3）人脐带血MSC的分离 取足月正常生长的胎儿脐带血，加肝素抗凝； 将肝素抗凝脐带血与等体积PBS混合，然后按4：1与0.5%甲基纤维素混合，室温沉降红细胞30min； 小心吸取上层液体，离心、弃上清，用PBS重悬细胞； 在离心管中先加入1.077g/ mL 的溶液，再将5mL细胞悬液铺于其上； 离心，以下步骤同上。 4.干细胞培养方法 饲养层细胞培养法 无饲养层培养法 5.3.1 饲养层细胞培养法 (1)常用的饲养层：小鼠胚胎成纤维细胞、STO细胞。 小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast, MEFs） MEF能抑制胚胎干细胞自主分化、促进胚胎干细胞增殖，故能有效促进胚胎干细胞增殖，并维持其未分化的二倍体状态和全能性。 (2)MEF饲养层细胞的制备 MEF的分离： 将性成熟雌小鼠(7～8周龄)与种雄鼠(8周龄以上)2：1比例合笼，每天早上 观察雌小鼠生殖道口，有乳白色或淡黄色胶冻状物(阴道栓)即确定为怀孕，见栓当天为怀孕0.5d； 取妊娠12.5～14.5d的孕鼠,断颈处死后,无菌取出胚胎，洗涤去除残余血迹； 去除胚胎头、四肢、内脏，将躯干剪成1mm3以下的碎块，吸至离心管内； 加入等体积胰蛋白酶 - EDTA消化液，轻轻吹打30次； 细胞离散后,加入等体积MEF培养液，终止胰蛋白酶的消化作用； 800～1000r/min离心5min，弃上清液； 加入5mL左右MEF培养液重悬鼠胚组织，制成细胞悬液,记数。 MEF的培养： 原代培养： 调整细胞浓度,接种于培养瓶中培养（一般5个鼠胚可使用1个100-150mL培养瓶），让组织悬液能均匀覆盖培养瓶表面，于37℃、5%CO2、饱和湿度，孵箱培养。 传代培养： 待成纤维细胞基本铺满培养皿底，用0.25%胰酶和0.04% EDTA消化吹打，置离心管静置5min,取上层液制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106～2×106个/mL（1：3比例），进行传代培养，一般采用3～5代作饲养细胞用。 MEF饲养层的制备： 方法：丝裂霉素C处理法、γ线照射法。 一定剂量的丝裂霉素（有丝分裂抑制剂）和γ射线能够使细胞停止分裂，但又立即死亡，在体外可维持一段存活时间。 可利用其处理饲养层细胞，使饲养层细胞不分裂，又能存活，并分泌抑制ES细胞分化和促进ES细胞增殖的因子，保证ES细胞的生长。 丝裂霉素C法： a. 选取MEF细胞生长旺盛的培养皿,加入有丝分裂抑制剂丝裂霉素C 10μg/mL（覆盖细胞单层即可），处理2～3h； b. 吸去处理液，用PBS标准培养液清洗2-3次,除去残余丝裂霉素C ； c. 用0.25%胰酶、0.04%EDTA消化液消化制成单细胞悬液,细胞计数、调整细胞 浓度为3.0×105个/mL； d. 接种到用0.1％明胶预处理过的培养瓶或培养皿中。 e. 37℃、5％C02、100％湿度孵箱培养，细胞很快贴壁并铺展为单层。这样制成的饲养单层可使用6～10d，使用前更换成ES培养液，其它细胞饲养层的制备方法基本同于MEF制备方法。 γ射线处理法: MEF或STO融合成单层后，用γ射线照射，剂量为30-100Gy，余下步骤同丝裂霉素C处理法(3)～(5)，照射过的细胞也可以5×106个/mL浓度冻存备用。 （3）小鼠纤维母细胞（STO细胞）培养 STO细胞是SIM小鼠