mdc抑制凝血酶诱导大鼠凋亡的研究.docx

mdc抑制凝血酶诱导大鼠凋亡的研究 脑出血对脑组织的毒性作用是目前脑出血病理生理机制的热点。虽然有许多重要的发现，但具体机制尚不清楚。我们以往的研究结果提示tTG可能参与了此机制, 对tTG的抑制不仅减轻了Tm对神经细胞毒性作用,而且干扰了Tm对NMDA受体敏感性的增强作用。以上研究结果均以培养细胞为实验材料,为了检测此结果与动物在体实验是否一致,我们用4种剂量的Tm注射入大鼠纹状体制作脑出血后Tm神经毒性的模型, 同时加入MDC以干预, 比较2种处理方式纹状体区神经细胞的损伤程度和凋亡细胞的数量以验证离体培养细胞实验结果。 1 材料和方法 1.1 实验动物 健康Wistar大鼠,雌雄不限,体重约250～300 g,由武汉大学医学院动物室提供。 1.2 tm0,5,10,5e,5e,10,10,10,10,5e,10,10,15e 24只大鼠分为2组,每组12只:实验组大鼠向右侧纹状体(定向仪参数为A5.8,L3.0,H0.2)注入溶有Tm0、5、10、15U的生理盐水5 μl, 每种浓度各3只共12只;对照组为0、5、10、15U的Tm加MDC 5mM的生理盐水,每种浓度各3只共12只。 1.3 主要设备 江湾-Ⅰ型C通用立体定向器由中国人民解放军第二军医大学制造;微量进样器由上海高欣玻璃仪器厂制造。 1.4 主要材料 TUNEL染色试剂盒购于德国宝灵曼公司;Tm和MDC购于美国Sigma公司。 1.5 实验方法 1.5.1 活力碘消毒联合配合 每只大鼠用20%乌拉坦腹腔麻醉,注射剂量为0.5ml/100 g。使用立体定向仪的齿钩和双侧耳钉三点固定大鼠头部,剪毛后活力碘消毒。头皮正中切口约1 cm,手术刀柄刮开骨膜,暴露前囟及矢状缝,于颅骨背侧前囟后0.2 mm,中线旁 3mm处用牙钻钻一小孔,微量进样器进针5.8mm, 注射不同处理的药物,注射速度为1 μl/5 min。注射完毕后留针5 min以防药物从针孔溢出。缝合头皮,活力碘消毒。各组大鼠常温苏醒后自由进食、进水。存活24小时后按照以下方法大脑纹状体部位取材。 1.5.2 动物脑电ldf 各组大鼠在相应时间点应用20%乌拉坦腹腔注射麻醉,剂量同上。迅速开胸暴露心脏, 灌注针头从左心室插至主动脉根部,在右心耳处剪开一小口作为出口。生理盐水150 ml快速灌注,2 min内灌完。4%冰多聚甲醛100 ml快速灌注, 动物四肢变硬,口唇和内脏变白。4%冰多聚甲醛200 ml持续滴注50 min,继续固定。断头取全脑,以注射孔为中心取约1 cm3的脑组织,同时取对侧相应部位做对照。保存于10%甲醛溶液中。 1.5.3 组织伤口的染色 组织包埋、切片及HE染色(具体方法略)。凋亡细胞检测;TUNEL法,按照试剂盒说明书操作(具体方法略)。 1.5.4 细胞凋亡细胞 HE染色切片显微镜下观察有无细胞损伤变化,如组织水肿、胞体肿胀、细胞核浓缩、核碎裂、核仁消失等;取纹状体脑组织切片做凋亡细胞TUNEL特异染色。对TUNEL染色切片用Imagepro软件做凋亡细胞计数,每张切片在300倍镜视野下取3个视野对凋亡细胞计数,取均值。 1.5.5 凋亡细胞计数 SPSS10.0统计分析软件进行均数和标准差的计算,对各组凋亡细胞计数,以均数±标准差(xˉ±s)(xˉ±s)表示凋亡细胞数。进行方差分析和多组数值的t检验。差异P0.05为有统计学意义。 2 结果 2.1 tm的鼠脑部位凋亡细胞 HE染色镜下观察,注射生理盐水的鼠脑纹状体区凋亡细胞极少;细胞形态正常,细胞核的核仁完整;注射生理盐水加MDC的鼠脑部位凋亡神经细胞亦极少,细胞形态变化亦不大,但二者均有脑组织水肿的表现,细胞与细胞间质间隙增加,可能是因为针刺损伤引起;注射Tm的鼠脑纹状体区均观察到神经细胞的损伤变化,细胞胞体发生肿胀,细胞核发生浓缩或固缩现象,部分细胞核仁消失,且Tm浓度越高异常形态的细胞越多;在对照Tm+MDC处理组织切片的异常细胞减少(图1～4)。 2.2 mdc对凋亡细胞数的影响 5、10和15U的Tm诱导凋亡细胞数分别为13.78±3.31、25.56±4.16和35.00±5.96个;同时加入MDC后凋亡细胞数分别为8.56±2.51、16.89±2.03和28.33±5.83个。对计数结果用统计软件SPSS10.0进行数据分析,在5、10和15U Tm浓度,MDC干预均减少Tm诱导的细胞凋亡(P0.05)(图8)。 3 tm抑制剂信号抑制机制 脑出血引起神经损伤的机制尚未完全清楚,有研究发现与血肿产生的Tm对中枢神经的毒性有关。研究者发现Tm能增加血脑屏障通透性,引起大分子物质进入脑组织,并引起神经细胞和细胞间质的水肿;而且Tm还能引起神经细胞的凋亡及中枢神经的炎症反应造成脑损伤。 现有关于Tm抑制剂的研究