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n-甲基-d-天冬氨酸受体与细胞内组织型谷氨酰胺转移酶关系的研究 脑出血是老年人常见的疾病，发病率、死亡率和致残率较高。这种疾病的神经损伤机制尚不完全清楚。迄今研究多集中于凝血过程中产生的凝血酶的神经毒性作用,认为凝血酶不仅可以引起脑水肿,可以诱导神经细胞凋亡,还能通过激活蛋白激酶激活受体(PAR)-1改变神经细胞N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的敏感性。凝血酶激活PAR-1可以引起大鼠脑皮质细胞内组织型谷氨酰胺转移酶(tTG)的蛋白表达和酶活性增高。为了解tTG这一多功能酶是否参与了凝血酶影响NMDA受体敏感性的机制,我们利用凝血酶作用于原代培养的大鼠小脑颗粒细胞,tTG抑制剂单丹磺酰尸胺(MDC)干预,对这一问题进行了研究。 实时荧光定量检测 1. 材料与仪器:Wistar大鼠鼠婴购于武汉大学医学院动物室;细胞培养板购于美国Falcon公司;DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购于美国Gibco公司;凝血酶、阿糖胞苷和NMDA购于美国Sigma公司;M-MLV逆转录试剂盒购于美国Promega公司;Taq DNA聚合酶购于中国华美生物工程公司;其他试剂为国产分析纯。使用EPICS ALTRAⅡ流式细胞仪(BECKMAN COULTER公司,美国),CellQuest软件获取数据,Modifit LT软件进行分析;BH-2显微镜(OLYMPUS公司 日本);二氧化碳培养箱(SHEL-LAB公司,美国)PCR仪购于德国Eppendorff公司;凝胶成像系统为美国GDs 7600凝胶扫描分析系统。 2. 方法:大鼠小脑颗粒细胞原代培养及分组:出生1 d的Wistar大鼠鼠婴,断头处死,解剖显微镜下取小脑,细胞培养至第20天,以神经元特异性烯醇化酶抗体做细胞鉴定,细胞纯度达到90%可进行实验。培养细胞分为3组:(1)空白对照组: NMDA加入培养液配成3个工作浓度(0.1×10-4mol/L、0.25×10-4mol/L和0.5×10-4mol/L)处理小脑颗粒细胞3 h;(2)实验组:0.01 U/ml浓度的凝血酶(不引起细胞凋亡的低浓度)预处理小脑颗粒细胞30 min后换液,用以上3个工作浓度的NMDA 处理3 h;(3)实验对照组:以0.01 U/ml Tm加0.5×10-4mol/L浓度tTG抑制剂MDC预处理小脑颗粒细胞30 min后换液,再用以上3个工作浓度的NMDA共同处理细胞3 h。 流式细胞仪检测细胞凋亡率。 tTG mRNA半定量检测 RT-PCR的方法扩增tTG mRNA,以β-actin为内参照,Gelpro图像分析软件对检测结果进行半定量分析。用DEPC水配制并预冷至4℃的PBS清洗细胞3次;采用Trizol试剂提取细胞总RNA。紫外分光光度计测样品RNA总量。取RNA 4 μg,逆转录试剂盒合成第一链cDNA。取第一链cDNA 2 μl,同一反应体系内PCR扩增tTG及β-actin 。引物序列:tTG(上游:5′GTTCCTGAAGGACCGTAGC3′,下游:5′GTTCCTGAAGG- ACCGTAGC3′),β-actin(5′CCTATGAGACAGCCAGAAT- C3′,下游:5′TCTTCATGGTGCTAGGAGCCT3′)。反应条件:95℃变性1 min,57℃退火1 min,72℃延伸1 min,35次循环。 3. 统计学方法:采用SPSS10.0统计软件进行统计学处理,计量资料结果(xˉ±s)(xˉ±s)表示,数据比较采用方差分析和q检验。 结果 1. 凝血酶预处理对mda细胞凋亡的影响 空白对照组NMDA3个浓度诱导的细胞凋亡率分别为(8.3±0.5)%、(14.1±1.1)%和(26.8±1.9)%;实验组细胞经0.01 U/ml浓度的凝血酶预处理30 min再加入以上3个工作浓度NMDA,各浓度NMDA诱导的细胞凋亡率均较空白对照组升高,分别为(15.1±0.8)%、(23.8±0.7)%、(33.7±2.1)%(P0.01)。提示经凝血酶预先处理后同样浓度的NMDA引起的细胞凋亡率升高,说明NMDA受体敏感性增高。实验对照组同时加入0.01 U/ml浓度Tm和0.5×10-4mol/L MDC处理细胞30 min后,再加入以上3个浓度的NMDA,细胞凋亡下降至(5.8±1.2)%、(11.5±1.5)%和(19±1.7)%,且低于单纯NMDA处理的空白对照组(P0.05);提示MDC抑制了凝血酶引起的NMDA受体敏感性增高。 2. nmda浓度 以RT-PCR的方法检测空白对照组和实验组tTG mRNA,产物大小为309 bp;以β-actin作为内参照,片断大小为623 bp;marker大小为100~1000 bp。1、3和5道为空白对照组,NMDA浓度分别为0