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蛋白质分离纯化 凝胶层析实验 一、实验目的: 1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理 2.学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术 二、实验原理 凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是:具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶(sephadex)和琼脂糖凝胶(sepharose)。 葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。 本实验以sephadex G-75作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖-2000和溴酚蓝。蓝色葡聚糖6分子量接近2*10，而溴酚蓝分子量为670，二者分子量相差较大，前者完全排阻，而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内，二者通过层析柱的时间不同而分开。 三、实验材料 1.实验器材 层析柱(1*30)，试管及试管架，紫外可见分光光度计 2.实验试剂 ?0.9%NaCl溶液 ?溴酚蓝溶液 ?蓝色葡聚糖-2000溶液 ?样品溶液:溴酚蓝溶液0.1ml，蓝色葡聚糖-2000溶液0.5ml混匀后为上柱样品溶液。 ?sephadex G-75 四、实验操作 1.实验凝胶的制备:5g sephadex G-75，加过量蒸馏水，搅拌均匀，沸水浴溶胀3h。倾泻除去凝胶上层水及细小颗粒，用蒸馏水反复洗涤几次，再以洗脱液洗涤2-3次，使pH和离子强度达到平衡，最后用真空泵抽6h，除去溶液及凝胶颗粒内部气泡。 2.装柱:将层析柱洗净，垂直固定在铁架台上，选择有薄膜端作为层析柱下口，将凝胶轻轻搅动均匀，用玻璃棒沿层析柱内壁缓缓注入柱中，装柱过程中严禁产生气泡，尽可能一次装完，避免出现分层。再用洗脱液平衡1-2柱床体积，凝胶面上始终保持有一定的洗脱液。平衡后，拧紧下端螺旋夹。 3.加样:打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出，直至床面与液面刚好平齐为止，关闭下端出口。取溴酚蓝及蓝色葡聚糖-2000混合液0.3ml，小心地加于凝胶表面上，切勿搅动层析柱床表面。打开下端出口，使样品溶液进入凝胶内，并开始收集流出液。当样品液恰好流至与凝胶表面平齐时，关闭下端出口。用少量洗脱液清洗层析柱加样区，共洗涤三次，每次清洗液应完全进入凝胶柱内后，再进行下次洗涤。最后在凝胶表面上加入洗脱液，保持高度3-4cm。 4.洗脱与收集:连接好凝胶柱层析系统，调节洗脱液流速为1ml/min，进行洗脱。仔细观察样品在层析柱内的分离现象，手机洗脱液，每收集3ml换一只收集管，收集约30管左右，样品即可完全被洗脱下来。测定各管洗脱液在540nm处的光密度。 5.凝胶回收处理方法:将样品完全洗脱下来后，继续用三倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶后，回收凝胶备用。 五、实验结果 以洗脱管号为横坐标，以光密度为纵坐标作图即得洗脱曲线。分析曲线图并讨论实验结果。 SDS分离鉴定蛋白质 实验目的 了解十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)DE JIBEN YUANLI ,学习并掌握SDS法分离鉴定蛋白质相的技术。 实验原理 本实验利用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，电荷和分子大小不一的牛血清蛋白和溶菌酶在SDS的作用下表面带上负电荷且分子形态呈棒状，消除不同分子间的电荷差异和结构差异，通过浓缩效应、分子筛效应将蛋白质分子分离开。 实验材料 1.实验器材 垂直板型电泳槽;直流稳压电源;50或100μL微量注射器;玻璃板;水浴锅;培养皿;脱色摇床;烧杯;吸量管;长头滴管等。 2.实验试剂 34?标准蛋白质 含牛血清蛋白(相对分子质量66*10)、溶菌酶(相对分子质量1.43*10)各0.02g左右。按照每种蛋白质1-2mg/mL的浓度，用样品溶解液(试剂10)配制，充分溶解。 ?分离胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液，pH8.9) ?浓缩胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液，pH6.7) ?30%分离胶贮液 ?10%浓缩胶贮液 ?10%SDS溶液 ?1%TEMED;10%过硫酸铵(AP)(现用现配) ?电极缓冲液(Tris-甘氨酸缓冲液，pH8.3) ?样品溶解液:取SDS100mg、甘油2ml、溴酚蓝2mg、0.2mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)0.5ml，加重蒸水至10ml。该试剂用以溶解标准蛋白质及待测蛋白质。 ?染色液:称取三氯乙酸12.5g，加水至100ml，再加入0.1g考马斯亮蓝R-250。 脱色液:7%乙酸溶液。 实验操作 1.分离胶的制备 将胶条、玻璃板、电泳槽都要洗净(勿用手接触灌胶面的玻璃)，干燥后安装凝胶模，保证其不漏水。若漏水，则需将玻璃用无水酒精擦拭干净后，重新安装凝