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大麦苗粉制品中大麦源性成分检测方法 PCR 法 1 范围 本文件描述了采用PCR法检测大麦苗粉制品中大麦源性成分的方法。 本文件适用于大麦苗粉制品中大麦源性成分定性检测，方法检出限为 0.25% （质量分数）。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本 （包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403-2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对 （basepair） Ct：阈值循环数 （cyclethreshold） DNA：脱氧核糖核酸 （deoxyribonucleic acid） dATP：脱氧腺苷三磷酸 （deoxy-adenosinetriphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸 （deoxy-cytidinetriphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸 （deoxy-guanosinetriphosphate） dNTPs：脱氧核糖核苷酸 dTTP：脱氧胸苷三磷酸 （deoxy-thymidinetriphosphate） EDTA：乙二胺四乙酸 （ethylene diaminetetraacetic acid） FAM：6-羧基荧光素 （6-carboxyfluorescein） PCR：聚合酶链式反应 （polymerasechainreaction） TAMRA：6-羧基四甲基罗丹明 （6-carboxytetramethylrhodamine） Taq：水生栖热菌 （thermusaquaticus） Tris：三 （羟甲基）氨基甲烷 （tris(hydroxymethyl) aminomethane） UNG：尿嘧啶-N-糖基化 （uracil-N-glycosylase） 18srRNA：18s 核糖体RNA （18Sribosomal acidRNA） 5 防止污染措施 1 防止污染措施应遵守GB/T27403-2008中附录D的规定。 6 第一法 特异性PCR 法 6.1 原理 以提取的大麦苗粉制品样品中的总DNA为模板，设计大麦源性成分的特异性引物进行PCR扩增， 以琼脂糖凝胶电泳检测是否出现预期目标片段，或利用测序进行确证，从而判定样品中是否含有相应的 源性成分。 6.2 试剂和材料 除另有说明外，试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水为GB/T 6682-2008规定的一级水。 6.2.1 dNTPs：dATP、dTTP、dCTP、dGTP。 6.2.2 10×PCR 缓冲液。 6.2.3 TaqDNA 聚合酶。 6.2.4 冰乙酸。 6.2.5 氢氧化钠。 6.2.6 溴代十六烷基三甲基铵 （CTAB）。 6.2.7 异丙醇。 6.2.8 琼脂糖。 6.2.9 溴化乙锭或其他可代替的染料。 6.2.10 6×loadingbuffer(上样液)。 6.2.11 DNA 分子量标记：100bp。 6.2.12 TE 缓冲液：在800mL 水中，依次加入 1mo/L Tris-HC 溶液10mL 和0.5mol/LEDTA 溶液2mL， 用水定容至1L，121C 灭菌15min，备用。 6.2.13 1×TAE 缓冲液：称取242gTris 和37.2g 的Na2EDTA·2H2O放入烧杯中加入约800mL 水，充 分搅拌，然后加入57.1mL 冰乙酸，用水定容至1L，配制成50×TAE 缓冲液，室温保存，使用时用水稀 释为1×TAE 缓冲液。 6.2.14 2%琼脂糖凝胶：称取0.8g 琼脂糖于锥形瓶中，加入40.0mL 1×TAE 缓冲液，加热溶解。 6.2.15 1mol/L Tris-HCL 溶液：称取60.55gTris-base 溶于适量水中，加 1mol/LHCl 调 pH 至8.0，定 容至500mL，103.4kPa 灭菌。 6.2.16 0.5mol/L EDTA 溶液：称取186.1gNa2EDTA·2