《细胞与显微技术学》细胞传代与冻存_2.pdfVIP

实验九、细胞传代与冻存 实验目的：掌握细胞冻存的方法，能独立地进行细胞冻存的操作。 实验原理： 当细胞在培养皿中长满后就需要将其稀释分种成多个培养皿,细胞才能 继续生长.这一过程就叫传代.传代培养可获得大量细胞供实验所需. 利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离 生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于 实验 。细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5％-15％的甘油或二 甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞 内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用慢冻快融的 方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃／min，当 温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。 实验材料 细胞株：培养的HeLa细胞 器材: 冻存管、离心管、5ml枪头、60mm Dish 水浴锅等 试剂：DMEM培养基、小牛血清、DMSO、胰蛋白酶 实验步骤：细胞传代 1.先准备好新培养皿，加入4.3mlDMEM，0.5ml BS. 2.用5ml移液管吸掉培养皿 （1个）中的旧培养基，用3mlPBS洗 去残留的旧培养基后，吸掉PBS，加入0.5ml胰酶，充分覆盖细 胞后，吸掉胰酶，室温静置3-5分钟，待细胞变圆漂浮起来后 （可在倒置显微镜下观察），加入4mlDMEM吹洗细胞，制成 悬浮细胞,移入5ml离心管中，1200rpm离心5分钟。去上清后， 加入1mlDMEM充分混匀细胞，取200ul加入上述准备好的培养 皿中，最后移入CO培养箱中继续培养。 （每组传一盘即可） 2 实验步骤：细胞冻存 1.冻存液的准备：取5ml离心管一个，按照7:2:1的比 分别加入DMEM、FBS、 DMSO，终体积为2ml. 2.用5ml枪头吸掉所有培养皿中 （9个）的旧培养基，每个培养皿中加入3ml PBS洗去残留的旧培养基后，吸掉PBS，分别加入0.5ml胰酶，充分覆盖细 胞后，吸掉胰酶，室温静置2-3分钟，待细胞变圆漂浮起来后 （可在倒置显 微镜下观察），在第一个培养皿中加入4mlDMEM悬浮细胞后,移入第二个 培养皿中，悬浮细胞，然后再移入第三个培养皿中，依次类推，最后将悬 浮液移入5ml离心管中，1200rpm离心5分钟。去上清后，加入1ml上述冻 存液，充分悬浮细胞，然后将细胞悬液移入冻存管中。在冻存管表面标明 日期、细胞名称、姓名。 3.将冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移 入液氮容器内。(每组冻存一管) 思考题 • 简述细胞传代的过程 • 简述冻存细胞的过程 实验十、荧光显微镜与暗视野 显微镜的使用 一一、、荧荧光光显显微微镜镜的的成成像像原原理理 荧荧光光显显微微镜镜是是一一种种较较为为常常用用的的的的光光学学显显微微镜镜，，其其 基基本本原原理理是是利利用用一一定定波波长长的的激激发发光光对对样样 进进行行激激 发发，，使使之之产产生生一一定定波波长长的的荧荧光光，，从从而而用用于于对对样样 结结构构或或其其组组分分进进行行定定性性、、定定位位、、定定量量观观察察检检测测。。 什什么么是是荧荧光光 ?? ■ 物物质质中中的的电电子子吸吸收收光光的的 能能量量由由低低能能状状态态转转变变为为 高高能能状状态态，，再再回回到到低低能能 状状态态时时释释放放出出的的光光。。 ■ 即即：：物物质质吸吸收收 波波光光，， 发发射射出出的的长长波波光光。。 荧荧光光的的性性质质 ■保保持持固固有有的的荧荧光光特特性性 ■荧荧光光波波长长＞＞激激发发波波长长 ■荧荧光光强强度度极极小小于于激激发发光光的的强强度度 ■有有不不同同程程度度的的衰衰减减 ■荧荧光光强强度度取取决决于于激激发发光光强强度度、、被被检检 浓浓度度 荧荧光光的的种种类类 自自发发荧荧光光