分子标记辅助选择.docx

第十七章分子标记辅助选择育种分子标记：以DNA多态性为基础的遗传标记分子标记的特点：1、遗传多态性高；2、在基因组中大量存在且均匀分布；3、稳定性、重现性好；4、信息量大，分析效率高第一节分子标记的类型及原理一、分子标记的类型1、以DNA-DNA杂交为基础的DNA标记技术：限制性片段长度多态性标记，简称RFLP标记；可变数目串联重复序列标记，简称VNTR标记；原位杂交，简称ISH2、基于PCR的DNA标记：1)单引物PCR标记；2)双引物选择性扩增的PCR标记；3)通过克隆、测序来构建特殊双引物的PCR标记。 3、基于PCR与限制性内切酶技术相结合的DNA标记。分为两类：限制性酶切片段的选择性扩增，如AFLP；PCR扩增片段的限制性酶切，如CAPs4、基于单核苷多态性的DNA标记：单核苷酸多态性，简称SNP二、主要分子标记1、RFLP(RestrictionFragmentLengthpolymorpams)限制性片段长度多态性1980，Bostein用限制性内切酶酶切不同个体的基因组DNA后，含有与探针序列同源的酶切片段在长度上的差异。 (1)RFLP标记的原理基因组DNA序列上的变化：碱基替换、插入、缺失或重复造成某种限制性内切酶(restrictionenzymes)酶切位点的增加或丧失以及内切酶酶切位点间DNA片段变化RFLP标记的分析步骤RFLP分析探针单拷贝或寡拷贝探针来源：cDNA克隆；基因组克隆(RandomGenome)；PCR克隆RFLP标记的特点优点：①数目几乎无限；②共显性；③可以利用现有探针，具有种族特异性；④FLP标记遍及全基因组；⑥重复性好缺点：成本较高；一个探针只能产生一个多态位点；需要许多克隆探针；所需DNA量大(5?15〃g)；易造成环境污染2、RAPD(RandomAmplificationPolymorphismDNA)随机扩增多态性DNA1990,Williams通过PCR扩增染色体组DNA所获得的长度不同的多态性DNA片段。 如随机排列的寡聚脱氧核苷酸单链引物(10个核苷酸)。 PCR，聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)Mullis等(1985)PCR反应：变性、复性、延伸。特异性取决于引物与模板DNA结合的特异性。 RAPD与经典的PCR反应的区别：①引物；②反应条件；③扩增产物AP-PCR(Arbitrarilyprimedpolymerasechainreaction)：任意引物PCR；引物长度与一般PCR反应中的引物相当；开始阶段退火温度较低DAF(DNAamplificationfingerprinting):DNA扩增指纹；引物长度比RAPD更短，为5?8个核苷酸；DAF复性和延伸常用同一种温度(2)RAPD标记的特点优点：1)可检测未知序列的基因组DNA；2)引物无种族特异性；3)RAPD技术简单；4)单个引物可产生几个多态位点；5)通过克隆测序可转化成SCAR(特异序列扩增区域标记)；缺点：1)再现性差；2)显性遗传；3)存在共迁移问题3、AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphisms)扩增片段长度多态性1993，Zabeaumarc和Vospieter是对限制性酶切片段的选择性扩增。 AFLP标记的原理：基因组的DNA进行双酶切；人工接头连接；PCR反应的引物；凝胶电泳限制性酶:酶切频率较高的限制性酶(frequentcutter)，产生易于扩增基因组DNA。酶切频率较低的限制性酶(rarecutter)，限制扩增模板DNA片段的数量。 AFLP扩增数量由酶切频率较低的限制酶在基因组中的酶切位点数量决定。 AFLP分析的基本步骤：1)限制性核酸酶双酶切基因组DNA；2)DNA片段两端连接上特定的接头；3)选择扩增；4)聚丙烯酰胺凝胶电泳；5)凝胶转移，干胶处理；6)自显影；(荧光标记、银染)AFLP标记的特点优点：1)数目和种类很多；2)一次PCR反应可检测多个遗传位点；3)AFLP分析模板用量少；4)分辨率高；5)假阳性低，可靠性高；6)AFLP标记多数为显性；缺点：分析成本高；DNA的纯度及内切酶质量要求也比较高；甲基化敏感酶易产生假假阳性。 4、SSR(SimpleSequenceRepeat)1987，Nakamura生物基因组内有一种短的重复次数不同的核心序列可变数目串联重复序列，简称VNTR(小卫星(minisatellites＞微卫星(microsatellites)简单重复序列，又称微卫星：DNA一类由1—6个碱基组成的基序(motif)串联重复而成的DNA序列。 SSR标记的原理：微卫星DNA两端的序列是相对保守的单拷贝序列。根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PC