crispr介导原核细胞rna干扰的免疫防御机制.docx

crispr介导原核细胞rna干扰的免疫防御机制 真核细胞的rn干扰（rci）是由双链钠引起的序列特异性基因沉默引起的。也被称为转录后基因沉默(post-transcriptional genesilencing,PTGS)。此过程由双链RNA(dsRNA)经RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)中的dicer核酶作用产生21~22 nt的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)。然后与RISC结合使siRNA解旋,产生成熟的siRNA。RISC-siRNA复合物结合到靶mRNA,通过slicer核酶将靶mRNA降解。释放的RISC-siRNA复合物可循环起到放大效应。RNAi系统广泛存在于真核生物中,是一种非常保守的进化机制,与真核细胞中的许多重要生物学过程密切相关。 在细菌中已发现60多种类似于真核细胞的小RNA(small RNA,sRNA)分子。它们大多作为应答环境压力的调节元件。绝大多数sRNA的调控机制是sRNA与靶mRNA配对,在结合RNA蛋白(RNA-binding protein)(如Hfq)的参与下,RNAase E降解靶RNA,从而在转录后水平调节细菌的基因表达,影响细胞的生理功能。研究表明RyhB与Fe2+结合蛋白mRNA作用降低铁离子利用;OxyS与FhlA mRNA作用降低细胞氧化损伤;DsrA与RpoS mRNA作用增强细胞对低温的保护;RygA和RygB(或OmrA和OmrB)与cirA、fecA、fepA和ompT mRNA作用调节细胞外膜组成。近年,利用已测序的原核细胞基因组数据,通过与真核细胞RNA干扰系统相关的蛋白质结构和功能的比对分析,表明原核细胞存在有siRNA参与的RNAi系统,并在新近得到了实验证实。与此同时,首次揭示了原核细胞的适应性免疫机制。 1 crispr的测序与序列特点 自1987年Ishino等首次在大肠杆菌中发现成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)后,相继在古细菌和真细菌中普遍发现了该类序列。不同的研究者曾给出不同的名称,如TREPs(tandem repeats),SRSRs(short regularly spaced repeats),DVRs(direct variant repeats),LCTRs(large cluster of 20-nt tandem repeat sequences),SPIDRs(spacers interspaced direct repeats)。2002年,Jansen等将它们统一定名为CRISPR。截止到目前的研究表明,CRISPR已构成了原核细胞的一个特殊的串联序列家族,在已测序的细菌中发现几乎所有的古细菌和一半细菌中存在有CRISPR。 CRISPR由一类DNA重复元件构成,每个元件由23~47 bp组成,典型呈串联排列,其间含有25~40bp的非重复的间隔序列,单一CRISPR通常含有4~100个以上的重复元件。大多数基因组含有单一的CRISPR,其重复序列几乎相同,表明在同一种内具有明显的保守性。然而,一些基因组含有多个CRISPR,但每个CRISPR的序列基本不同。不同基因组中CRISPR的重复序列相似性较小,但经常含有远缘种(包括古细菌和细菌)共有的不同的保守模体。 CRISPR中的一些间隔序列与染色体外成分紧密相关[23~25]。在古细菌中,该序列与微小纺锤形噬菌体(fuselloviruses)和古噬菌体(rudiviruses)以及硫叶菌属(Sulfolobus)的接合质粒序列相似;在细菌中,多种嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的间隔序列与不同的噬菌体或质粒序列相似。在耶尔森菌属(Yersinia)的菌株中,3个小的间隔序列与含有缺陷的类λ噬菌体的染色体区相似。这些研究结果表明CRISPR中的一些序列可能来自于染色体外组分。 2 构、模体的比对分析 在研究CRISPR的过程中,人们发现一些基因总是定位在CRISPR附近。进一步分析研究表明,在一些古细菌和细菌中,大多数含CRISPR的基因组中至少含一些这类基因序列。鉴于这类基因的存在与CRISPR有着密切关系,人们将其定名为CRISPR相关(CRISPR-associated,cas)基因。Jansen等在含有CRISPR的菌株中首先发现4个cas基因(cas1,cas2,cas3,cas4),之后得到了他人证实。这些cas基因通常头尾相连,排列顺序依次为cas3-cas4-cas1-cas2,似乎同时转录。