33核酸类的药物.pptx

第三章 生化药物制造工艺（核酸类药物） ? 第一节 核酸类物质的分离提取及其发酵生产 ? 一、RNA与DNA的提取与制备 （一）RNA的提取与制备 1、工业用RNA的提取 （1）RNA及其工业来源 从微生物中提取RNA是工业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰富的核酸资源，如酵母、白地霉、多种抗菌素的菌丝体——青霉素，制霉菌素等菌体。 通常在细菌中RNA占5％～25％，在酵母中占2.7％～15％，在霉菌中占0.7%～28％。; 在菌体内RNA含量的变化受培养基组成影响，其中关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率高，易于提取RNA。 很显然在许多酵母中，早期细胞中的RNA含量高，其确切数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。 （2）高RNA含量酵母菌株的筛选 可以从自然界筛选到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱变育种的方法提高酵母菌的RNA含量。;LINYI UNIVERSITY;LINYI UNIVERSITY; （二）DNA的提取与制备 1．工业用DNA的提取 取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状，加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌，升温至100℃，保温15分钟，迅速冷却至20～25℃，离心除去鱼精蛋白等沉淀物，获得35L含热变性DNA的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解生产脱氧核苷酸。如要制成固体状DNA，在热变性DNA溶液中逐渐加入等体积95％乙醇，离心可获得纤维状DNA，沉淀用乙醇、丙酮洗涤，减压低温干燥得DNA粗品，产品含热变性DNA50％～60％。;LINYI UNIVERSITY;LINYI UNIVERSITY;LINYI UNIVERSITY;二、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸 （一）酶解法及碱水解法制备核苷酸 1、酶解法制备脱氧核苷酸 桔青霉产生5’-磷酸二脂酶 红酵母产生3’-磷酸二脂酶; ;2、酶解法制备戊糖核苷酸 我国从60年代开始使用核酸酶P1降解核糖核酸生产单核苷酸，日本年产呈味核苷酸（肌苷酸和鸟苷酸）3000吨，其中60%是使用酶解法生产的。 酶解法生产5’—单核苷酸工艺流程;;;4．菌体自溶法生产核苷酸 　　磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA可产生5′-核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法生产5‘-核苷酸。 （1）菌体自溶法生产核莆酸工艺流程：;5．???水解法生产2＇，3＇-混合核苷酸 RNA结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定，很容易生成2′，3-环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更不稳定，很易加水分解生成2＇，3＇-混合核苷酸。取RNA配成3％～3.5%的水溶液，加氢氧化钠达0.3mol／L浓度，升温至38℃，保温16～20小时，用6mol／L盐酸中和至pH7.0，从RNA水解成2′，3＇-核苷酸的降解率达95％以上，将2′，3＇-混合核苷酸制成每片含50～100mg的片剂，经临床使用，对非特异性血小板减少症、对白血球减少症、癌肿的化疗和放疗后的升白血球均有较好疗效。;LINYI UNIVERSITY;（二）发酵法生产核苷酸 1．发酵法生产肌苷酸（IMP） 肌苷酸钠是一种高效增鲜剂，在谷氨酸钠（味精）中加2%，鲜度可增加3倍。因此，在味精中添加肌苷酸钠（或鸟苷酸钠）后成为第二代特鲜味精。 产氨短杆菌嘌呤核苷酸生物合成途径、代谢调控和肌苷酸发酵机制: ; ; 积累IMP的主要前提： （1）阻断SAMP合成酶: 即选育缺该酶的菌株（嘌呤缺陷型），发酵前期提供适量腺嘌呤，以满足菌体生长； （2）保持 PRA 合成畅通，即后期没有多余腺嘌呤阻遏该步反应； （3）要使IMP渗出胞外，选育对Mn+不敏感菌株； （4）生成的IMP不被降解，恰好原菌株该酶活力低。;（三）半合成法制备核苷酸 由于发酵法生产核苷的产率很高，核苷悬浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷却条件下加入氯化氧磷，进行磷酸化，从核苷生成5′-核苷酸收率可达90%。 例一：肌苷2mmol／L悬浮于5ml磷酸三乙酯中，温度控制0℃，添加氯化氧磷6mmol／L，水2mmol／L，反应2h，5＇-IMP摩尔产率达91％。 例二：鸟苷2mmol／L悬浮于5ml磷酸三甲酯中，温度控制0℃，添加氯化氧磷6mmol／L，水2mmo/L，反应6h，5＇-GMP摩尔产率达90%。;三、核苷的制备 核苷是多种核苷类药物的原料，在核酸类药物中占主导地位。 （1）以核苷及其结构类似物、衍生物为主药物多达几十种； （2）核苷类药物在抗病毒、抗肿瘤、增强免疫方面占重要地位； （3）核苷的发酵水平大大高于核苷酸，所以常做后者的前体物质。