《蜂王浆中蜂王浆主蛋白4的测定 酶联免疫吸附法》 编制说明.docxVIP

《蜂王浆中蜂王浆主蛋白4的测定 酶联免疫吸附法》 编制说明  一、工作简况 （一）任务来源 根据农业农村部农财发[2019]77号文件《农业农村部关于下达2019年农业行业标准制定和修订项目资金的通知》，中国农业科学院蜜蜂研究所承担了标准《蜂王浆中蜂王浆主蛋白4的测定酶联免疫吸附法》的制定工作（项目计划编号：农财发[2019]77号2019026）。在完成标准的全部研究工作后，研究单位依据中华人民共和国农业农村部“十三五”全国农产品质量安全提升规划中相关规定，以及全部实验结果、方法验证结果起草了本检测方法文本和编制说明。 （二）制定背景 1. 意义 蜂王浆是一种具有滋补保健和延年益寿功能的天然功能性蜂产品。蜂王浆不易保存，极易变质，因而，蜂王浆的品质和其新鲜度紧密相关。现行的蜂王浆国标（GB/T 9697-2008）和国际标准（ISO 12824:2016）对蜂王浆的评价和质控具有指导性意义，但缺乏真实反映蜂王浆新鲜度的指标和检测方法，这也是现行蜂王浆质量标准的一个缺陷，并对产业可持续发展留下一定隐患。中国是世界蜂王浆第一生产国和第一出口国，因此，探求和建立蜂王浆新鲜度评价方法势在必行。 蜂王浆是蜜蜂哺育蜂咽下腺和上颚腺的分泌物，是一种极其不稳定的天然产物，对储藏条件要求较高。研究表明，在室温下储藏1周，蜂王浆中蛋白质就有明显降解，储藏1个月就会发生质变。随储藏时间的增长，蜂王浆颜色加深，黏度增大，产生气泡；水溶性蛋白和单糖含量降低，可滴定酸增加，维生素C含量降低，SOD酶活力下降，抑菌性下降。因此，蜂王浆的储藏和保鲜一般在隔氧避光条件下进行低温冷冻保藏。若储藏不当，其各种性状(物理或化学)及其品质就会发生显著变化，蜂王浆的各种活性成分损失，其保健功能就会大幅降低，甚至丧失。 不饱和脂肪酸10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)又称王浆酸，是自然界中，仅在蜂王浆中存在的一种特殊生物活性物质。蜂王浆国标和国际标准都对蜂王浆中10-HDA的含量进行了规定，但由于10-HDA即使在高温下也不会大量分解，因此，10-HDA并不适合作为蜂王浆新鲜度的评价指标，但作为蜂王浆真假的判断标准，其含量能在一定程度上反映蜂王浆的质量。 我们采用高分辨质谱和生化检测方法对蜂王浆中的所有蛋白质进行了一个随贮存温度和时间的监测，发现蜂王浆中可溶性蛋白质随贮存温度的升高和时间的加长都有很大程度的降解。王浆主蛋白家族（Major Royal Jelly Proteins，MRJPs）是蜂王浆中最主要的一类蛋白质，其含量占蜂王浆可溶性蛋白质含量的80%以上。其中，MRJP1、MRJP2、MRJP3、MRJP4和MRJP5约占MRJPs总量的82%～90%，其含量直接影响蜂王浆的功能。在这5种蛋白质中，蜂王浆主蛋白3-5由于含量相对较低，变化差异大，表现对温度敏感，在室温和4 ℃存放随时间延长而逐渐降解。其中，蜂王浆主蛋白4对温度更加敏感，在36℃条件下存放3天，MRJP4就已经完全降解而检测不到。同时，通过我们的蜂王浆抑菌实验发现，36℃存放3天后，蜂王浆水溶液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和幼虫芽孢杆菌的抑制作用显著降低，MRJP4的含量与这蜂王浆的抑菌效果趋势完全一致。因此，我们认为MRJP4可真实反映蜂王浆新鲜度，是蜂王浆品质的标志，应纳入优质蜂王浆质量指标。 蜂王浆冻干粉通过真空冷冻干燥方法加工制成的脱水蜂王浆粉末，一般是3公斤的鲜蜂王浆做1公斤的蜂王浆冻干粉。蜂王浆冻干粉相比于鲜纯蜂王浆更易储存，可长期冷藏保存。但与新鲜蜂王浆一样，蜂王浆冻干粉也存在贮存和功效的问题。新鲜蜂王浆制备的蜂王浆冻干粉，以及贮存条件较好的蜂王浆冻干粉其营养价值更高，功效更好。因此，蜂王浆中MRJP4的含量也可反映其质量。 研究通过抗原抗体反应，筛选出特异性好灵敏度高的抗体对，建立MRJP4酶联免疫吸附（ELISA）检测方法，能够实现对蜂王浆和蜂王浆冻干粉中MRJP4的定量。这将为完善蜂王浆质量标准，有效监控蜂王浆新鲜度，进一步规范蜂王浆市场奠定基础。 2. 国内外研究概况 蜂王浆主蛋白作为评价蜂王浆新鲜度的标准并非我们第一次提出。日本科学家Kamakura 等人在2001年就提出，随着温度升高和储存时间的延长，蜂王浆中MRJPs的含量也显著降低，其中一种57 kD的蛋白可作为评价蜂王浆新鲜度的指标 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [1]。我国也有研究者针对MRJP1建立了ELISA检测方法，预通过准确定量MRJP1浓度来评价蜂王浆新鲜度 ADDIN EN.CITE EndNoteCiteAuthorShen/AuthorYear2015/YearRecNum2380/RecNumDisplayText[11]/Di