DNA与RNA提取方法模板.docxVIP

试验三 Trizol 法提取细菌总 RNA 一、试验原理 Trizol 主要物质是异硫氰酸胍 ,它可以破坏细胞使 RNA 释放出来的同时 ,保护RNA 的完整性。参与氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA 存在于水样层中。收集上面的的水样层后 RNA 可以通过异丙醇沉淀来复原。无论是人、动物、植物还是细菌组织 Trizol 法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≧1 g)和细胞(107)均有较好的分别效果。Trizol 试剂操作上的简洁性允许同时处理多个的样品。全部的操作可以在一小时内完成。Trizol 抽提的总RNA 能够避开 DNA 和蛋白的污染。 二、主要试剂和器材 Trizol 溶液 氯仿 异丙醇 75%乙醇 0.1% DEPC 水 超净工作台 2.0 mL 离心管 无 Rnase 移液枪 紫外分光光度计 石英比色皿 泳槽和模具 电泳仪 凝胶成像系统 大肠杆菌 三、试验步骤 — . 承受 Trizol 溶液提取细菌的总 RNA 挑取大肠杆菌菌单菌落 培育至稳定期 取菌液 2.0 mL 于 2.0 mL 离心管离心得菌体 2、 每管参与 1 mL Trizol 溶液 盖紧管盖 猛烈振荡 15 s 室温静置 5 min 4℃ 12023 g 离心 10 min 取上清转入(约 1 mL)的 2.0 m L 离心管中 3、每管参与 0.2 mL 的氯仿(0.2 体积 Trizol) 盖紧盖 猛烈振荡 15 s 室温静置 3 min 4℃, 12023 g, 离心 10 min，留神吸取上层水相转入另一的 2.0mL离心管，测量其体积,加氯仿时应充分震荡使其充分乳化。 4、参与 1 倍体积的氯仿，盖紧盖，猛烈振荡15 s，室温静置 3 min，4℃12023 g 离心 10 min 留神吸取上层水相，转入另一已编号的 2.0mL 离心管。 5、参与 0.5 mL 的异丙醇(0.5 体积 Trizol) 轻轻颠倒混匀，室温静置 10 min， 4℃12023 g 离心 10 min，RNA 沉于管底，留神吸去上清 6、加 1 mL75%的乙醇(预冷) ,并轻柔颠倒，洗涤沉淀 4℃ 7500 g 离心 5 min,留神弃上清，微离吸去剩余乙醇，室温干躁 10 min。 7、 各管用 30μL DEPC 处理过的双蒸去离子水溶解，55-60℃温育 5 min，分装， -80℃贮存(可贮存 5 周)。二 . RNA 浓度的测定 取 10 μ L RNA 样品以双蒸水稀释至 2 mL 转入预先以无水乙醇隔夜浸泡后晾干的石英比色皿中，留神排解气泡，以等体积的双蒸水作为空白比照。在紫外分光光度计中分别测定 260 nm、280 nm 的光吸取值。依据公式计算 RNA 的浓度。RNA 浓度(μg/μL)= OD260 × 稀释倍数(200)× 40(μg/mL)/1000 纯 RNA 样品的 OD260/OD280 比值为 1.8~2.0 假设低于该值，说明存在蛋白质污染 ，可重用酚∕氯仿抽提。该值为 2.0 时 RNA 纯度为最高。 三 . RNA 质量检测 将 RNA 进展琼脂糖凝胶电泳检测，目的在于检测 23 S 和 16S 条带的完整性和它们的比值。一般认为 假设 23 S 和 16 S 条带光明、边缘清楚 并且 23 S 的亮度在 16 S 条带的两倍以上 则 RNA 的质量较好。 将洗净、枯燥的电泳槽和模具 水平放置在工作台上 准确称取 0.15 g 琼脂糖参与 15 mL 1 × TAE 中,摇匀,在微波炉内将琼脂糖 溶液以最短时间完全溶解 (中火档 2 min),待冷却至 60℃时,参与 EB(终浓度为μ L/mL),充分混匀。 (3) 插入适当的梳子，将温热的凝胶倒入胶模中，凝胶厚度为 3~5 mm，置于室温下凝固。 待凝胶凝固后，留神移去梳子，将凝胶置于电泳槽中，参与电泳缓冲液使液面高出凝胶 1~2 mm。 用微量移液器将样品8μ L与上样缓冲液2μ L 混合并将混合液留神参与上样孔内，同时参与适宜分子量范围的 DNA 分子量标准作为比照 2023bp。 盖上电泳槽盖 调整电压 100 V 电泳 15min 左右。 电泳完毕后将凝胶置于紫外透射检测仪上观看结果 用凝胶成像系统照相保存。 四、留意事项 1. RNA 制备的关键是要抑制细胞中的 RNA 分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA 分解酶的污染。EP 管及 Tip 头都要用 0.1%处理(0.1% DEPC 浸泡过夜后高压蒸气灭菌)。用于 RNA 试验的试剂 须使用 DEPC 水处理灭菌后的玻璃容器盛装 使用的无菌水须用 0.1%的 DEPC 处理后再进展高温高压灭菌。最好在超净