基于RSAP标记的大花三色堇遗传多样性分析.docx

? ? 基于RSAP标记的大花三色堇遗传多样性分析 ? ? 李小梅，杜晓华，穆金燕，刘会超 （河南科技学院，河南新乡453003） 大花三色堇（Viola×wittrockiana.Gams.），又名蝴蝶花、猫脸花，为堇菜科（Violaceae）堇菜属（ViolaL.）园艺杂交种，由三色堇（V.tricolorL.）、黄堇（V.luteaHuds.）及阿尔泰堇菜（V.alticaKer Gawl.）杂交获得［1］。因其色彩艳丽、花色丰富、花期长、耐寒等优点而成为春秋季重要的花坛与盆栽花卉，在欧洲、美国和日本十分盛行，近年在中国城乡美化中开始大量应用，市场需求快速增长［2］。然而，目前中国大花三色堇生产用种子主要依赖进口，其品种主要为F1代，价高且适应中国生境的品种较少［2］。加快培育具有中国自有知识产权、适应中国生境的大花三色堇品种是当务之急。长期以来大花三色堇育种主要集中在欧美和日本等国的种子公司，因涉及商业秘密，外界对资源间的遗传关系不甚明了。对从各地引进的大花三色堇种质资源进行遗传多样性分析对于大花三色堇种质资源的收集、分类和育种具有重要的指导意义。 在大花三色堇种质资源研究方面，杜晓华等［3］基于表型对来自国内外的33份资源进行遗传差异分析。Ko等［4］将RAPD 标记和表型相结合研究了30种堇菜属植物的亲缘关系。Yockteng等［5］利用ITS与ISSR 标记研究了25种美丽堇菜亚属植物的系统分类。Culley等［6］用ISSR 标记分析了美国俄亥俄州6个堇菜种质亲缘关系，研究城市生境与种质基因的关系。王健等［7］用RAPD 标记研究了18个三色堇自交系的遗传多样性。王涛等［8］采用SRAP标记研究了43份三色堇与角堇资源的遗传多样性。限制性位点扩增多态性（restriction site amplification polymorphism，RSAP）是一种基于基因组上广泛分布的限制性酶切位点多态性的DNA标记系统，具有操作简便、稳定、中等产率等特点［9］。该标 记已在辣椒［10］、紫菜［11］、红花檵木［12］、大白菜［13］、龙须菜［14］、苎麻［15］、重楼属［16］、麦冬［17］等 植物的遗传多样性分析中被广泛应用［18］。但目前尚未见其在堇菜属植物上的应用报道。 本研究随机选取了从国外育种公司和国内育种单位引进后纯化以及本单位选育的41份大花三色堇种质资源，采用RSAP标记技术对其进行遗传多样性分析和亲缘关系分析，旨在为大花三色堇种质资源的收集、分类与种质创新提供依据，并评价RSAP标记系统在大花三色堇遗传多样分析中的适用性及其效力。 1 材料与方法 1.1 材料 供试的41份大花三色堇种质资源为多年自交纯化的自交系（表1），由河南科技学院新乡市草花育种重点实验室提供。 1.2 方 法 1.2.1 RSAP分析 以大花三色堇幼嫩叶片为材料，采用SDS法提取总DNA［19］。 RSAP分析方法参照杜晓华等［10］的方法进行，采用10条RSAP引物（表2），组成45对引物组合，对41份大花三色堇资源进行分析。PCR 扩增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系共25μL，其中模板DNA 为20ng，Mg2＋浓度2.5 mmol／L，dNTPs浓度0.2 mmol／L，TaqDNA 聚合酶为1.5 U，2条引物均为600nmol／L。PCR 扩增程序为：94 ℃预变 性5min；94 ℃变性1 min，35 ℃退火1min，72 ℃延伸1min，5个循环；94 ℃变 性1 min，45 ℃退 火1 min，72 ℃延 伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10min，4 ℃保存。PCR扩增在Biometra Tgradient PCR 仪上进行。扩增产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，先在60 W 功率下预电泳30min，加样后在75 W 功率下电泳2.5～3h，银染检测，具体参照许绍斌等［20］的方法进行。 1.2.2 数据分析 RSAP分析产生的多态性条带，按二元数据进行统计，有带记为“1”，无帯记为“0”，模糊不清带不统计。每对引物组合的多态性比率（%）＝引物组合扩增的多态性条带数／总条带数×100，每个引物的鉴别能力（%）＝此引物组合可鉴别的材料数／总材料数×100。采用POPGENE version 1.32 软件计算每对RSAP引物的有效等位基因数、Nei’s遗传多样性指数和Shannon信息指数。采用MVSP 3.1 软件计算各材料间和组群间的Nei’s相似系数和遗传距离，并进行基于UPGMA法的聚类和主坐标作图。 表1 供试的41份大花三色堇种质资源信息Table1 Basic information of 41pansy germplasms used in th