基于ITS2序列的海桐皮及其混伪品DNA分子鉴定.docx

? ? 基于ITS2序列的海桐皮及其混伪品DNA分子鉴定 ? ? 田 荣，吴 云，谷 巍，单鸣秋，谷宇琛，马丽杰，裴凌峰 ? 药材与资源 ? 基于ITS2序列的海桐皮及其混伪品DNA分子鉴定 田 荣1，吴 云2#，谷 巍1*，单鸣秋1，谷宇琛1，马丽杰1，裴凌峰1 1. 南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023 2. 江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001 应用ITS2条形码技术，对海桐皮及其混伪品进行分子鉴定。通过提取31份海桐皮药材基原植物刺桐、乔木刺桐及其混伪品的基因组DNA，扩增ITS2序列并测序；同时从GenBank下载混伪品序列15种38条，运用MEGA 7.0软件进行序列比对，进行种间序列差异分析比较，并构建Neighbor-jioning（NJ）系统进化树，预测ITS2二级结构。在海桐皮2种基原中，刺桐的ITS2序列长度为232 bp，乔木刺桐的ITS2序列长度为230 bp，均为单倍型，可以明显区分；同时与其他刺桐属及易混品之间遗传距离较远。NJ树结果显示刺桐、乔木刺桐及其他易混品均单独聚为一支，表现出良好的单系性；依据ITS2二级结构，刺桐、乔木刺桐及其混伪品在4个螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均有明显差异，可以直观地将刺桐与乔木刺桐，以及其与易混品进行区分。ITS2序列作为DNA条形码能稳定、准确鉴别海桐皮药材，为保障安全用药提供了新的技术手段。 海桐皮；刺桐；乔木刺桐；易混品；ITS2；物种鉴定 海桐皮为豆科植物刺桐L. var.(L.) Merr. 或乔木刺桐Roxb. 的干燥树皮。其味苦、辛，性平，具有祛风湿、通经络、杀虫等功效。主治风湿痹痛、痢疾、牙痛、疥癣。其也常用作抗菌剂、抗炎剂、退热剂及防腐剂?[1]。化学研究发现海桐皮所含主要次生代谢产物为生物碱、黄酮及异黄酮类化合物?[2]，其中黄酮及异黄酮类化合物有抗菌、抗炎、抑制Na?+/H?+交换系统活性及抑制磷脂酶A2的活性?[3]。海桐皮的提取物还具有抗肿瘤活性，可通过稳定G-四链体结构，进而抑制端粒酶的活性，破坏肿瘤细胞的永生化，最终导致肿瘤细胞凋亡?[4]。 本草考证表明海桐皮史载于《开宝本草》。《本草图经》云：“海桐皮，出南海以南山谷，今雷州及近海州郡亦有之。叶如手大，作三花尖。皮梓白而坚韧，可做绳，入水不烂。”又云：“岭南有刺桐，叶如梧桐，花侧敷如掌，枝干有刺，花色深红。”按植物形态描述及来源证明与今之海桐皮原植物刺桐相似，且从《本草纲目》《本草推新》《本草备要》的插图也可以看出其为豆科刺桐属植物。 海桐皮药材存在严重同名异物，药用情况混乱、质量不可控的问题，且用药混乱问题由来已久，混用品颇多，且都为不同科属植物，如五加科植物刺楸(Thunb.) Koidz.的干燥树皮（川桐皮），芸香科植物椿叶花椒（食茱萸）Sieb. et Zucc.和朵椒Rehd. 的干燥树皮（浙桐皮）等?[5]。同名药材来源的多样性容易混淆使用并使得临床疗效不确定。由于缺乏专业的鉴定人员，而从外观上海桐皮与其他混伪品难以区分，容易造成混用。因此，亟待建立一种迅速、简便有效的鉴定方法来区分海桐皮及其易混品以确保海桐皮种质、种源，保障临床安全用药。 DNA条形码是当前生物分类学的热门技术，是利用一段有足够变异的、易扩增且相对较短的标准DNA片段（500～1000 bp）对物种进行快速、准确的自动鉴定。作为DNA候选序列的ITS2片段因其具有较强引物通用性、较高测序成功率以及足够的序列变异性，而被大家广泛关注?[6]。当前，国家药典委员会讨论通过在《中国药典》增补本中列入中药材DNA条形码分子鉴定指导原则，该指导原则规定植物类药材的DNA条形码鉴定以ITS2序列为主，其鉴定能力也在药用植物多个科属基原植物及药材的鉴定中得到了验证?[7-13]。 迄今，海桐皮基原刺桐和乔木刺桐的分子鉴定少见报道。本研究提取刺桐、乔木刺桐及易混品植物DNA并测定其ITS2序列进行分子鉴定，旨在为海桐皮药材的快速准确鉴定及开发利用奠定基础。 1 材料和仪器 1.1 材料 2018年4～10月，从福建、广东、贵州、云南、浙江省收集刺桐、乔木刺桐及其易混品样品34份，均由南京中医药大学谷巍教授鉴定为刺桐var.L.、乔木刺桐Roxb.、鸡冠刺桐L.、韩氏刺桐Verdc.、翅果刺桐(Hassk.) Merr.、龙牙花L.、蝙蝠刺桐Benth.、绒毛刺桐Willd.、乙状刺桐Hua.、簕欓花椒(Lam.) DC.、楤木(Miq.) S(L.) Gaertn.、栓翅刺桐eem.、木棉L.、吉贝Roxb.、劲直刺桐Roxb.、塞内加尔刺桐DC.、刺楸(Thunb.) Koidz.、椿叶花椒Sied. et. Zucc.、大叶臭花椒Wall. ex Hook