基于rapd分析的罗汉果主要品种遗传多样性研究.docx

基于rapd分析的罗汉果主要品种遗传多样性研究 汉诺威是一种双壳类动物。这种水果是传统的中药，可以用来治疗支气管炎、急性喉咙炎、哮喘和感冒。果实中还含有一种热量低但甜度极高的物质，是理想的天然甜味剂(李典鹏和张厚瑞,2000)，可作为肥胖症和糖尿病患者理想的糖替代品。罗汉果主产广西，已有300多年的栽培历史，广西永福县和临桂县是传统的罗汉果产地，是栽培罗汉果的起源地(周良才等,1981,广西植物,1(3):29-33)。 遗传多样性是遗传改良的基础，种质分化的知识对作物改良具有重要的影响(Huang et al.,2002)。近年来，在PCR基础上发展起来的RAPD技术(Williams et al.,1990)以其流程简单、安全快速、花费不高、实用性好，得到了广泛的应用(李晓东等,2003Souframanien and Gopalakrishna,2004)，为遗传多样性评估的有效方法之一。 本研究应用RAPD标记方法对8个品种及雄株共75份栽培罗汉果样品进行了分析，目的在于研究栽培罗汉果的遗传多样性，为栽培罗汉果种质资源的保护和利用提供科学的依据。 1 材料和方法 1.1 样品采集和测定 实验材料采自广西永福县龙江乡、临桂县茶洞乡和融安县雅瑶乡(表1)。采集到的植株叶片，插入水中带回实验室，存放于-70℃超低温冰箱中备用。总共采集到75份样品：雌株样品62份，其中61份分属青皮果(Q)、红毛果(H)、爆棚果(B)、茶山果(C)、冬瓜果(D)、马铃果(M)、长滩果(T)、拉江果(La)8个品种，另有1份样品所属品种不确定，以当地习惯花皮果(Ha)命名；雄株(Y)样品13份。 1.2 总dna提取与纯度 采用CTAB法(Doyle and Doyle,1987)提取罗汉果叶总DNA，并用酚/氯仿法纯化。 1.3 pcr扩增条件的确定 实验所用RAPD引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。从200条引物中筛选出21条扩增条带清晰、反应稳定的引物用于全部75份DNA样品的扩增，各RAPD引物名称及序列见表2。 RAPD扩增反应条件经过比较和优化确定为25μl的PCR反应液内含：约30～50ng模板DNA,1U Taq酶，1×PCR缓冲液，2.0mmol/L Mg Cl2,4种dNTPs各0.2mmol/L,0.5μmol/L引物。PCR扩增程序为：94℃预变性5min，接着进行45个循环：94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸2min，循环结束后72℃延伸10min。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离，用Lambda DNA/Eco RⅠ+HindⅢmarker作为标准分子量对照，溴化乙锭(EB)染色，凝胶成像仪上观察、照相、记录。所有扩增反应均重复1次。 1.4 rapd扩增带分析 RAPD是显性标记，同一引物的扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性，按照相同迁移位置上有扩增带记为1、无带记为0的方法记录电泳谱带，构建0,1原始矩阵。仅清晰、可重复的并且长度在300～2 000bp范围内的RAPD扩增带才被记录。分别统计所得到的总扩增位点数、多态性位点数和多态位点百分比(PPL)。 根据RAPD的0,1矩阵，利用POPGENE 1.31软件(Yeh et al.,1997)，分别统计主要品种(青皮果、红毛果、爆棚果、茶山果和冬瓜果)及雄株的位点总数和多态位点数、多态位点百分率(PPL)和Shannon信息多样性指数(I)(Lewontin,1972)。应用NTSYS-pc version 2.02软件(Rohlf,1998)基于Dice(1945)相似性系数，分别对雌株和雄株做主成分分析(PCA)，并通过SHAN程序中的UPGMA方法进行单株聚类。 2 结果与分析 2.1 青皮果、红毛果、爆爆果之间的遗传相似性 用21条RAPD引物对75份样品的总DNA进行扩增，所有扩增反应均重复1次，两次PCR扩增产物重复性好且稳定，扩增得到的位点数及多态位点百分率见表2。总共记录到了130个位点(平均每个引物6.1个)，其中92个是多态性的，多态位点百分率为70.77%。引物S43得到的位点数最多，为10个；引物S113和S148得到的位点数最少，均为3个。除S15无多态性，其余20个引物都表现出了多态性。其中引物S108扩增得到的带型见图1。 按各品种及雄株分别统计扩增的总位点数、多态性位点数、多态位点百分率和Shannon信息多样性指数(I)(表3)。5个主要品种和雄株的多态位点百分率在23.08%～55.56%之间，Shannon信息多样性指数在0.0571～0.2135之间。青皮果(38.82%,0.0997)、红毛果(35.80%,0.1014)、爆棚果(23.08%,0.0571)的遗传多样性