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杨树基因标记的研究进展 杨树科和杨树科共有100多种植物分布在欧洲、美国和亚洲。它们是保护森林、水土保护林、绿树和人类工林公石的重要树种。近年来，森林科学家对生理生化、解剖构造等基本资料进行了深入研究，对促进柳树遗传改良产生了重大影响。然而，传统育种中的抗病、抗虫性、性别决定和早期造林选择等问题并不能从根本上解决。因此，应尽快研究杨树的生物学。 杨树种间杂交和无性繁殖容易, 杨属所有种的染色体数均为2n=38, 核基因组相对较小 (2 c=1.1~1.2 pg) , 便于遗传操作, 并已建立较完善的遗传转化体系, 获得了转基因植株. 因此, 杨树是公认的林木生物学基础研究中的模式树种. 由于杨树种间杂交容易, 在F1代有很强的杂种优势 (材积生长量) , 杂种的F2代在许多性状方面可发生广泛的分离, 所以大量的分离群体在F1代或F2代很易建成. 十几年来, 前人利用分子标记技术对杨树基因组进行了指纹图谱绘制、遗传图谱构建及数量性状基因定位. 在杨树中, 常用的分子标记为RFLP, RAPD和AFLP, 它们是继形态标记 (Morphological markers) 、细胞学标记 (Cytological markers) 和生化标记 ( Biochemical markers) 之后发展起来的一种以DNA多态性为基础的新一代遗传标记. 与形态标记和生化标记相比, 分子标记具有明显的优越性:大多数分子标记是共显性的, 基因组变异极其丰富, 分子标记的数量几乎是无限的, 在植物发育的不同阶段, 不同组织的DNA都可用于标记分析;分子标记不受环境影响, 其变异只源于等位基因DNA序列的差异, 与不良性状无必然的连锁, 不需专门创造特殊的遗传材料[7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20]. 基于上述这些优点, 分子标记技术可为杨树生产提供准确、可靠的遗传标记. 1 林分密度标记rflp和双荧光标记rapds 分子标记是分子生物学发展的产物. 80年代初, 发展了RFLP, 随后其发展极为迅速, 产生了多种分子标记技术, 用于杨树遗传育种的主要有以下3种. (1) RFLP RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) 指限制性片段长度多态性, 是杨树遗传育种中使用较多的一种分子标记. RFLP在林木遗传育种中的应用是从1986年开始的, 迄今也开展了大量的研究. RFLP技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小. 其基本步骤包括基因组DNA的限制性酶切, 电泳分离, 利用探针进行Southern杂交来检测基因组DNA. RFLP标记具有共显性的特点, 结果稳定可靠, 重复性好, 特别适应于建立连锁图. 然而, RFLP必须经过DNA酶切、电泳、Southern杂交, 费时、费力、周期长, 每次实验检测的位点较少, 对DNA需求量较大 (5~10 μg) , 需用放射性同位素或非放射性物质标记探针, 探针的种属特异性较强, 杨树已有的探针不超过300个, 这是RFLP应用在杨树中的主要问题. 另外, RFLP对DNA多态性检出的灵敏度不高, RFLP连锁图上还有很多大的空间区 (Gaps) . (2) RAPDs RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNAs) 为随机扩增多态性DNA, 是一项基于PCR技术基础之上, 用一个随机引物 (8~10个碱基) 非定点地扩增DNA片段, 然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA多态性研究[7,8,9,10,11,12,13]. 与RFLP相比, 它较便宜, 方便易行, 非常灵敏, DNA用量少, 实验设备简单, 不需DNA探针;设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析, 不依赖于种属特异性和基因组的结构, 合成一套引物可以用于不同生物基因组分析, 用一个引物就可扩增出许多片段, 而且不需要同位素, 安全性好. 因此, 继RFLP之后, RAPD是在杨树研究中应用最广泛, 特别是在寻找与目的基因连锁的分子标记方面, 报道最多. 但是, RAPD受条件影响很大, 因此对设备、条件及超作的要求都很严格, 若达不到要求, 稳定性和重复性就很难保证, 解决的办法是严格控制实验条件, 使用相同的PCR仪和引物. (3) AFLP AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) 扩增片段长度多态性, 是1992年由荷兰Keygene公司科学家Zabeau 和 Vos 发明创造的一种DNA分子标记新技术. 其基本原理是植物基因组DNA经限制性内切酶双酶切后, 形成分子量大小不等的随机限制性片段, 将特定的接头