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11种木霉对黄瓜枯萎病的拮抗作用 由于保护区的特殊环境条件，病害的发生非常严重。其中，枯草病、灰霉菌病和叶霉菌病最为严重，造成20%以上的损失和40%以上的损失。而黑星病是近几年蔓延开来的一种检疫性病害。对于这些病害的防治长期以来一直依赖于化学农药。但由于化学农药的使用一方面诱发病菌抗药性加剧,另一方面增强了农药对环境的污染及农药残留问题,这与当前绿色、环保的需求恰好相反。自1932年Weindring发现木霉对病原菌具有拮抗作用以来,哈茨木霉(T.harizanum)、康宁木霉(T.koningii)、钩状木霉(T.hamatum)、绿色木霉(T.viride)、长枝木霉(T.longbrangchiatum)、粘绿木霉(T.virens)[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13]就被广泛进行了拮抗作用、机制和防治效果的研究。但多集中于土传病害的抑制作用,而对叶部病害病原菌的抑制作用研究的较少。本试验用从蔬菜保护地土壤中分离到的11种不同种类的木霉对黄瓜枯萎尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、黄瓜黑星病瓜疮痂枝孢霉(C.cucumerinum)和番茄叶霉病褐孢霉(F.fulva)的拮抗作用、拮抗机制和防治效果进行了研究,以期为将来进行多功能生防菌剂的配制和田间应用提供一定的数据。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 离培养菌株鉴定 从河北省昌黎县蔬菜保护地中采集黄瓜、番茄病叶和病茎进行分离培养,鉴定为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysprorium)、瓜疮痂枝孢霉(Cladosporium cucumerinum)和褐孢霉(Fulvia fulva)。 1.1.2 木霉素 从河北省不同地区蔬菜保护地中蔬菜根际土壤中采用稀释分离法进行分离,经形态学鉴定为不同种类的木霉,编号分别为M1～M11。 1.2 病原菌和木霉菌生长和抑菌率测定 采用平板对峙培养法,用直径5 mm的打孔器取新鲜培养的木霉和3种病原菌的菌丝块,将木霉与病原菌分别同时接入PSA平板(培养皿直径9 cm),两者相距5 cm,5次重复,分别以病原菌和木霉在PSA上的纯培养为对照,25 ℃恒温培养,逐日观察菌落的生长和木霉菌的抑制作用,连续观察7～10 d,待对照菌丝长满培养皿时测量处理病原菌菌落半径,计算抑菌率。 抑菌率=[ (对照菌落半径-对峙菌落半径) /对照菌落半径]×100% 当木霉与病原菌对峙培养的菌落接触后,从界面处挑取菌丝做涂片,在光学显微镜下直接观察两种菌丝的交接情况和两者间的相互作用。 1.3 覆盖、培养、测定黄瓜枯涣病 将抑菌效果较好的菌株进行温室防效测定,黄瓜种子经表面消毒催芽后播种于直径10 cm的营养钵内,每盆2粒种子。当黄瓜苗长到2～3个复叶时,向瓜苗根际土瓖中注射浓度为107cfu/mL木霉菌孢子悬浮液,每株接入5 mL孢子悬浮液,用无菌土覆盖2～3 cm。3 d后接入尖孢镰孢菌孢子悬浮液(105cfu/mL),每株接入3 mL。对照只接种尖孢镰孢菌,每个处理12盆,3次重复。25 d后调查发病率、计算病情指数及相对防治效果。 黄瓜枯萎病分级标准:从根系判断0级为须根完好;一级为10%以下须根变褐;二级为11%～50%须根变褐;三级为50%以上须根变褐,但地上部不萎蔫;四级为50%以上须根腐烂,地上部萎蔫至枯死。 病情指数=∑(各级病叶面积数×各级代表值)调查总叶面积数×最高级代表值×100=∑(各级病叶面积数×各级代表值)调查总叶面积数×最高级代表值×100 相对防效=对照病情指数?处理病情指数对照病情指数×100%=对照病情指数-处理病情指数对照病情指数×100% 2 结果与分析 2.1 木霉种类鉴定 依据Rifai和Bissett等的分类标准,对所分离到的木霉进行了种类鉴定,M1～M11分别为深绿木霉、桔绿木霉、黄绿木霉、顶孢木霉、长枝木霉、粘绿木霉、康氏木霉、拟康氏木霉、钩状木霉、非钩木霉和棘孢木霉。 2.2 生长迅速,抑菌效果好 经过对峙培养测定,11种木霉对3种病原菌均有一定的抑制作用,但抑菌强度存在较大的差异(表1)。其中,M6(粘绿木霉)对3种病原菌均有较强的抑制作用,对镰刀菌、瓜枝孢和褐孢霉的抑菌率分别为80%,47.63 %和76.5%。而M1(粘绿木霉),M5(长枝木霉)和M7(康氏木霉)只对一种病原菌拮抗作用较强,对另外两种病原菌抑制作用均较低,M1对镰刀菌、M5对瓜枝孢和M7对褐孢霉的抑菌率分别为51.92%,59.2%和47.3%。 同时还观察到,木霉与病原菌同时接种到PSA平板上后,木霉的生长速度快于病菌,M1,M4,M5,M6,M7和M10生长旺盛,产生了大量短绒状气生菌丝和分生孢子丛。挑取对峙面的菌丝观察还可以看出,木霉与病原菌互作中存在着多种机制,多数可使病菌菌