影响植物农杆菌转化效率的因素.docx

影响植物农杆菌转化效率的因素 自20世纪80年代以来，转移技术及其在植物遗传改良中的应用引起了科学家的兴趣。人们尝试利用不同转化方法对植物进行改良,如基因枪介导、农杆菌介导、花粉管通道、电击穿孔等,培育了抗虫棉花、抗虫玉米、抗除草剂大豆、抗除草剂油菜、抗病毒木瓜、延熟番茄、高维生素含量水稻、抗旱小麦等转基因植物新品种和新材料,在农业生产上发挥了重要作用。其中,农杆菌介导是比较成熟、应用比较广泛的转化方法。农杆菌转化系统是一种天然的生物转化体系,自从Zambryski等利用农杆菌介导法成功获得转基因烟草以来,农杆菌介导法的转化机理和应用逐渐得到人们的关注。农杆菌包括根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes),它们是两类寄主非常广泛的土壤细菌,分别携带Ti质粒(tumor inducing plasmid)和Ri质粒(root inducing plasmid),两种质粒上都含有一段可转入植物细胞内的T-DNA(transfer DNA),在自然状态下通过侵染受伤的植物组织,将T-DNA上的目标基因转入植物细胞,进一步进入细胞核,整合到受体材料的染色体上。其转化具有一定的主动性,且具有操作简单、成本低、转化DNA片段明确、基因拷贝数低、发生转基因沉默相对较少、转移的基因片段较长、转化效率较高等优点。但农杆菌介导存在受体基因型特异性、组织培养过程容易污染、重复性不强等问题,在一些植物上的应用受到限制。 目前,除了大多数双子叶植物以外,很多单子叶植物也可以利用农杆菌进行转化。尽管农杆菌介导转化植物的范围在不断扩大,但传统的农杆菌介导的遗传转化在很大程度上依赖组织培养和共培养技术。事实上,农杆菌介导的植物遗传转化是农杆菌菌株与植物细胞之间相互作用的结果,包括农杆菌附着、Vir诱导、T-DNA加工、T-DNA和相关Vir蛋白进入受体细胞的细胞质、T-复合体在细胞质中的转运和进入细胞核、T-复合体卸载包装、T-DNA整合、T-DNA基因表达和植株再生等众多复杂的步骤。凡是影响农杆菌侵染能力、植物细胞应答农杆菌侵染能力,以及转化体再生能力的各种因素都将直接影响转化效果。对一些难转化的植物来说,辅助因素对转化的成败及其效率起着至关重要的作用,这些辅助因素不但可以促进农杆菌对受体细胞的侵染,而且能够减轻农杆菌侵染后导致的植物细胞褐化死亡现象,促进T-DNA的转运和向受体基因组上的整合,从而达到提高植株再生率和转化效率的目的。本文就影响农杆菌转化的有关辅助因素,如抗氧化剂使用、干燥处理、微创伤处理、核基质附着序列和表面活性剂使用等方面的研究进行了综述,为进一步改进农杆菌介导难转化植物的遗传转化效率提供参考。 1 超声波辅助农杆菌诱导的植物转化技术 农杆菌在植物细胞壁表面的吸附和附着位点是农杆菌与植物细胞相互作用的关键。农杆菌介导转化植物的一个主要步骤是为T-DNA转入受体细胞创造一个合适的条件或环境。在农杆菌介导的植物转化过程中进行超声波和负压辅助处理有助于提高转化效率,两种微创伤处理方法的原理都是在外植体的表面产生微伤口,使外源基因容易进入。微创伤处理强度太大会影响植株的再生,太小则达不到应有的效果,均影响转化效率的提高。因此,在研究中需要探索超声波和负压处理的强度、时间等参数。 超声波辅助处理对外植体的伤害主要来自2个方面,一是超声波造成外植体损伤,Santarém等利用显微镜观察到经过超声波处理的大豆子叶表面和深层有大量的微小伤口,随超声波处理时间的延长,外植体损伤趋于严重,可能由超声波的空化效应引起,空化作用具有瞬时性和稳定性。在超声波处理过程中,在液相介质里形成许多小气泡,这些小气泡达到一定大小后就会爆裂,爆裂产生的震动波或引起的介质快速运动足以对细胞和大分子物质造成机械损伤,因此在组织表层细胞壁和细胞膜上产生许多微小的伤口;二是由于超声波的热化作用,超声在介质中传播时产生的能量会使介质的温度升高,从而对外植体造成伤害。高强度的超声波可导致细胞破碎和酶失活,但超声波处理强度和时间适宜时,细胞自身能修复细胞壁和细胞膜的损伤,因而不影响细胞的生物活性。 Trick等首次将超声波技术用于农杆菌介导的植物遗传转化中,建立了超声波辅助农杆菌转化技术(sonication-assisted Agrobarterium-mediated transformation,SAAT),即对在农杆菌菌液中的外植体进行短时间的超声波处理。他们研究了SAAT对大豆未成熟种子、豇豆嫩叶、玉米未成熟胚、小麦和白云杉种子转化效率的影响,发现所有供试材料经SAAT处理后都显著提高了GUS瞬时表达率,而没有经SAAT处理的对照材料中GUS瞬时表达率则较低。电子显微镜观察发现,经SAAT处