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苦参的主要生物碱对体外抑制马拉松色菌作用的研究 马拉粉菌是一种常见的嗜脂性菌，存在于人类及文血动物的正常皮肤上。它属于子带菌亚门-色空菌纲和银座黑粉菌科-玛拉溪菌。马拉色菌感染的发病率日益增加,但目前抗菌西药存在疗效欠佳、不良反应多、耐药等缺点。从中草药中寻找广谱、高效、低毒的抗真菌新药已成为药物研究的热点,研究主要集中在治疗马拉色菌相关皮肤病及中药单体抑制马拉色菌方面。因此本文选取了目前抑菌疗效公认的苦参作为研究对象,通过苦参不同制剂以及苦参的主要成分苦参碱、氧化苦参碱与西药酮康唑粉进行体外抑菌实验,比较抑菌作用的优劣,寻找抑菌最佳的剂型或成分并探讨中药抑菌作用和机理。 1 材料和方法 1.1 酮康唑粉公司通/难以分布在中国的原料 苦参粉:取北京中医药大学东方医院中药房苦参饮片100 g在医院制剂室采用小型中药粉碎机(广州康诺,型号:SF-130)研磨成细粉过120目筛,过3遍。 苦参颗粒剂:由北京康仁堂生产。1 g相当于饮片10 g,共取10 g。(批号:国药,按照饮片管理) 苦参碱、氧化苦参碱:由湖北午时药业股份有限公司生产。(国药准字 酮康唑粉:由西安杨森制药有限公司生产,含量99.9%,溶于2.5%二甲基亚砜(MDSO)溶液,控制MDSO终浓度低于1%。 实验菌种:实验用合轴马拉色菌菌株(临床菌株:01780 CBS7222,标准菌株:01899 M.Sympodidalis),为北京医科大学医院真菌实验室李若瑜教授惠赠。 主要仪器:麦氏比浊管、高压灭菌锅(SANYOMLS-3020)、水浴箱(北京市医疗设备厂)、恒温培育箱(XMT-152C,重庆四达实验仪器厂)、超净台(造鑫企业有限公司)、显微镜(OLYMPUS-BX60F5)、血球计数板(上海市求精生化实剂仪器有限公司,批、一次性玻璃实管(直径10 mm×75 mm,爱思进塑料台州有限公司,批号071110)、电子天平(沈阳龙腾电子称量仪器有限公司)、双层铁皮电炉(上海武定电器厂,CL-A型220伏1200瓦)、8×12孔圆底酶标板(中国北京化工厂)。 1.2 设置培养基浓度 通过改良美国国家临床实验室标准化委员会制订的M27-A方案中酵母菌微量稀释法,对合轴马拉色菌标准株进行体外抑菌实验,在同一条件下找到苦参粉组、苦参免煎颗粒组、苦参碱组、氧化苦参碱组、酮康唑组五组对合轴马拉色菌的体外抑菌的最佳浓度。 参考其他类似实验设计用马拉色菌液体培养基对药物进行稀释,考虑药液浓度越高,培养基浓度越稀,这样设计的缺陷是没有考虑到培养基浓度对于真菌生长的影响。本次实验中改用生理盐水将药液进行稀释,而96孔板和试管中的菌液浓度、液体培养基的浓度都保持一致。此设计可以排除培养基浓度不同给实验结果带来的干扰因素。为尽量减少实验误差,每种药物的抑菌实验在相同实验条件下至少重复10次,结果取均值。 1.2.1 培养抗菌剂 (1)用接种环挑合轴马拉色菌标准菌株接种于橄榄油固体培养基上,37℃恒温温箱培养2天;(2)连续传代培养2次;(3)用无菌生理盐水洗脱纯化的菌落,制成菌悬液;(4)用比浊仪调整其至麦氏4号比浊管浓度;(5)用血细胞计数板计数其菌含量,并调其浓度为(1.0～2.0)×107CFU/ml;(6)在96孔板上每孔用移液器加入菌液100 μl。 1.2.2 制备法及微生物 (1)液体培养基的配置:麦芽糖浸膏1.6 g、蛋白胨2.4 g、葡萄糖5 g、蒸馏水500 ml,称取上述原料放入烧瓶中,加入蒸馏水用玻璃棒搅拌10分钟,使其充分溶解,然后装入试剂瓶中;高温高压灭菌90分钟(103.4 kPa,121℃);灭菌后,放入4℃冰箱储存备用。(2)按照每孔加入100 μl后分别含药液100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%的比例将苦参粉组、苦参免煎颗粒组、苦参碱组、氧化苦参碱组、酮康唑组贮备液直接用合轴马拉色菌液体培养基各配置10个浓度。(3)同时设一组阴性对照:每孔加入合轴马拉色菌液体培养基200 μl;一组阳性对照:每孔加入制备好的菌液100 μl及合轴马拉色菌液体培养基100 μl。(4)每种药同时做5组。(5)在摇床上将菌液及药液混匀5分钟。放入35 ℃恒温箱孵育。 1.2.3 酮康唑注射液浓度的筛选 为了保证体外实验的准确性,在液体培养基96孔板方法基础上,又增加了一组液体培养基试管组,以互相验证。苦参粉组、苦参颗粒组、苦参碱组、氧化苦参碱组、酮康唑药液浓度稀释和制备方法同前。但考虑到试管体积较大,液体量太小不适合进行浊度的比较,故放大液体10倍,并增加至15个浓度来进行实验。试管总的液体容积为6 ml,将5组中每组的10个管内分别加入菌液1 ml、不同浓度药液1 ml、培养液1 ml。