一种含新霉素磷酸转移酶的重组逆转录病毒的浓缩方法.docxVIP

一种含新霉素磷酸转移酶的重组逆转录病毒的浓缩方法 作为一种真正的细胞遗传遗传因素转移的载体系统之一，病毒反演反演过程病毒以其高效感染主细胞，稳定整合到主细胞组，并将其传给后细胞。同时，高度感染的病毒数量也是确保在转移基因转移研究中更好地应用于迁移率等。因此，病毒反演过程中的病毒筛选减少，体积减少，滴度增加，已成为推动转型反演过程体系研究的重要方面。本研究旨在通过差速离心、滤膜截留两种方法的比较及条件的优化,建立可行、高效的重组逆转录病毒的浓缩方法,获得带有标记基因的、具有理想感染滴度的重组逆转录病毒载体系统,从而为使用该系统进行转基因研究奠定了坚实的基础。 1 材料和方法 1.1 菌株和培养基 含有新霉素磷酸转移酶Ⅱ(Neor)重组逆转录病毒载体pLXSN及用于感染靶细胞NIH3T3细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室孟庆文博士惠赠。大肠杆菌DH5α为本室保存菌种。包装细胞系PA317细胞由本室保存,PA317和NIH3T3细胞均用含10%小牛血清的DMEM营养液增殖,维持液为含2%小牛血清的DMEM营养液。工具酶、一般试剂及培养基均购自Promega公司与 Takara 公司。脂质体Lipofectin、G418均为GIBCO公司产品。Centricon-30 浓缩器为Millipore公司产品。SCP55H型超速冷冻离心机,日立公司产品。日本电子GJEM1200EX2型透射电镜,本校中心实验室提供。 1.2 方法 1.2.1 病毒载体的检测 按文献方法进行 1.2.2 dmem—G418对于PA317细胞的最小致死剂量的测定 24孔板接种适量的PA317细胞,次日,待其长成50%左右时,加入G418浓度分别为300、400、450、500、550、600、700、800μg/ml的DMEM—10营养液,每日观察细胞状态,大约一周后,根据细胞死亡情况确定G418对于PA317细胞的最小致死剂量。 1.2.3 病毒载体的筛选 参照Lipofectin说明书及文献,用Lipofectin及磷酸钙两种介质将病毒载体导入包装细胞系PA317,并以最小致死剂量的G418进行筛选。 1.2.4 病毒浓缩方法 将得到的G418抗性克隆在含有G418(300μg/ml)的选择培养液中扩大培养,收毒前一天将阳性细胞1∶4分传,细胞贴壁后,加入半量的、新鲜的完全培养液,2—3天后收取培养上清。 差速离心法浓缩病毒 具体步骤为4℃,10000rpm(6,250×g)离心15min,弃沉淀,上清于4℃,80,730×g离心2h,离心管置于冰浴条件下,1%体积的完全营养液回悬沉淀,回悬时使用同一吸管以避免损失,约每15min吹打一次,避免产生气泡(气泡的产生会使病毒蛋白变性)。 滤膜截留法浓缩病毒 具体步骤为:将上清加入Centricon-30浓缩器,4℃,6,250×g离心10min,弃去滤液,用回收管封闭滤器,倒置,4℃,6,250×g离心10min,回收浓缩液。 电镜观察 收取浓缩病毒,2%磷钨酸负染,透射电镜观察。 1.2.5 g218对nih3t3的最小致死剂量 24孔板接种适量的NIH3T3细胞,次日待其长成50%左右时,加入含有G418浓度分别为300、400、500、600、700、800、900、1000μg/ml的DMEM—10营养液,每日观察细胞状态,大约一周后根据细胞死亡情况,确定G418对于NIH3T3的最小致死剂量。 1.2.6 polyhene病毒的感染途径培养 参考文献,用改进的方法进行滴度测定。具体步骤为:感染前1天将NIH3T3细胞按1万/孔接种24孔板,过夜。感染当天,移去培养液,加入低血清培养液1ml(含病毒上清0.1μl、1μl和5μl),加800μg/ml的polybrene储液至终浓度4μg/ml。37℃感染1—3h。加入低血清培养液1ml,将polybrene稀释至2μg/ml,培养48h。用选择培养液1∶4分传NIH3T3细胞,培养3天。换含G418最小致死剂量的选择培养液(含G418)。共培养7—10天后。待克隆出现时,进行克隆计数。根据公式:滴度(RCFU)=克隆数×稀释度×10,计算滴度。 2 结果 2.1 多元双酶切鉴定 经KpnⅠ单酶切得到2.75kb、3.1kb两条带,经HindⅢ、XbaI双酶切得到了1.6kb、4.2kb两条带(鉴定结果见图1)。 2.2 g418对pa317细胞的最小致死量的测量 G418对于PA317的最小致死剂量为0.3g/L。 2.3 基于plxsn抗性克氏原螯虾的转染效果 用脂质体Lipofectin介导与磷酸钙介导两种方法,经多次转染,0.3g/LG418筛选,得到了多个整合有pLXSN抗性克隆(相同条件下,两种方法的转染效果的比