MTT法检测细胞活力精讲.pptVIP

MTT法检测细胞活力;MTT法目的和意义;原理;活细胞+MTT;贴壁细胞操作步骤; 4. 每孔参加10ul MTT溶液〔5mg/ml，即0.5%MTT〕，继续培养4h。假设药物与MTT能够反响，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再参加含MTT的培养液。 5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。 6. 每孔参加100ul二甲基亚砜〔置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。 7.同时设置调零孔〔培养基、MTT、二甲基亚砜〕，对照孔〔细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜〕 ;悬浮细胞操作步骤：;药物的配制;MTT的配制;实验结果统计学处理;实验结果统计学处理;举例;本卷须知;实验前应明确的问题;2.药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。 3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了〔到了平台期〕那个时间点应该就是最好的时间点〔因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显〕。;4.培养时间。100ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。 ? 5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。 ? ; ? 7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组参加不同浓度的药物。 ? 8.防止血清干扰。用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内剩余培养液。;关于细胞的接种〔铺板〕;MTT本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新??，20％的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。 注意细胞悬液一定要混匀，已防止细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量防止人为误差。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。 ;如何去除上清;参加DMSO;OD值的测定; 谢谢观看MTT法检测细胞活力;MTT法目的和意义;原理;活细胞+MTT;贴壁细胞操作步骤; 4. 每孔参加10ul MTT溶液〔5mg/ml，即0.5%MTT〕，继续培养4h。假设药物与MTT能够反响，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再参加含MTT的培养液。 5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。 6. 每孔参加100ul二甲基亚砜〔置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。 7.同时设置调零孔〔培养基、MTT、二甲基亚砜〕，对照孔〔细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜〕 ;悬浮细胞操作步骤：;药物的配制;MTT的配制;实验结果统计学处理;实验结果统计学处理;举例;本卷须知;实验前应明确的问题;2.药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。 3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了〔到了平台期〕那个时间点应该就是最好的时间点〔因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显〕。;4.培养时间。100ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。 ? 5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。 ? ; ? 7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组参加不同浓度的药物。 ? 8.防止血清干扰。用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增