CIK细胞制备流程.docx

CIK细胞的制备方法（仅供参考）【背景】CIK是“Cytokine-InducedKillerCells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子包括IFN-g,IL-等）的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞（自然杀伤细胞）的非MHC（主要组织相容性抗原）限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。 【培养原理】CIK培养用细胞因子和抗体：nCD3激发型单抗： T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体（Tcellantigenreceptor,TCR）与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶（Lck,Fyi和ZAP-70等），促使CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM的酪氨酸（Y）磷酸化。磷酸化的酪氨酸（pY）进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应（磷脂酰肌醇途径或MAP激酶途径等），最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因（如IL-2和IFN-g等），引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。 由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用°CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。 此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。 nIL-2白细胞介素-2）IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子（Tcellgrowthfactor,TCGF是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体（IL-2R的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2以促进T细胞的增殖与活化。 nIFN-g干扰素-g)IFN-g具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN-g，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。先加入IFN-g培养24后再加入IL-2可明显提高CIK的细胞毒活性。 nIL-1a白细胞介素-1a)IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时，可以明显提高CIK的细胞毒作用。 【细胞制备】1.外周血单个核细胞的采集1.1用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞50-100mL；1.2淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；1.3无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC。 2.CIK细胞的培养及鉴定2.1将PBMC按1-2x106/m的浓度悬浮于无血清培养液中，加入1,000U/ml的重组人IFN-g，37oC，5%CO2培养箱中培养；2.224h后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和300U/ml的重组人IL-2刺激CIK细胞的生长和增殖；注：此时也可同时加入100U/ml的重组人IL-12.3每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2300U/ml2.4在培养的第14d，收获CIK细胞。 2.5CIK细胞质控： 2.9.1台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；2.9.2流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。 2.9.3细胞杀伤实验：以CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶