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-淀粉酶热稳定性及失活动力学研究 i-淀粉酶（i-1，4-葡萄糖-4-葡萄糖水解酶）是一种内切淀粉酶。根据c-1和4-葡萄糖糖的含量，随机解码-1，产生糊精和还原糖。i-淀粉酶主要来源于枯草杆菌、地衣菌、嗜热脂肪芽菌、米曲霉、黑曲霉、链霉菌、丙酮-丁醇梭菌、拟内孢酶等微生物和动植物组织。目前，ii-淀粉酶广泛应用于纺织、轻化工业、食品、造纸、医药、石油开采等领域。 α-淀粉酶作为一种生物催化剂, 因高温条件下半衰期短、易失活等缺点严重影响其使用效果.如用于织物前处理退浆只能低温堆置, 要提高退浆率唯有延长处理时间.因此, 提高酶的热稳定性, 以扩大其应用领域的研究已越来越引起人们的关注.目前, 提高酶热稳定性的方法有:添加稳定剂、化学修饰、固定化、蛋白质工程技术等, 其中在液体酶制剂中加入热稳定剂是一种最经济有效的办法.王耀兵等人在60℃条件下加入2.5 mmol/L Rb+或Li+能将淀粉酶的稳定性提高1.25~1.5倍;25~50 mmol/L Na+能将稳定性提高2.3倍;25~50 mmol/L K+能将稳定性提高1.7倍.本文研究了醋酸钙、乳酸钠对α-淀粉酶热稳定性的影响以及热失活动力学性质. 1 实验 1.1 淀粉、碘、碘化钾 材料:α-淀粉酶 (科凯精细化工上海有限公司) , 醋酸钙、乳酸钠为化学纯, 可溶性淀粉、碘、碘化钾为分析纯. 仪器:超级恒温器 (上海市试验仪器厂) , 电热恒温水浴锅 (上海医疗器械五厂) , 精密增力电动搅拌器 (上海硕光电子科技有限公司) , UV-VIS型分光光度计 (上海精密科学仪器有限公司) , 电子天平 (上海精科) . 1.2 测试方法 1.2.1 酶活力测定 显色法测定酶活:取1 m L酶液 (5 g/L) 加入到1m L淀粉溶液 (2 g/L) 中, 在40℃恒温水浴条件下反应8 min后用0.5 m L盐酸溶液 (1 mol/L) 终止反应, 再加入2 m L碘-碘化钾溶液 (0.2%I2-2%KI) , 稀释至50 m L, 以2 m L碘-碘化钾溶液和0.5 m L 1 mol/L的盐酸溶液为空白溶液, 在570 nm处测定吸光度.利用标准曲线将吸光度换算成相应酶活. 酶活力单位 (1 U) 定义为:40℃时, 1 min内1 mg酶水解的淀粉量 (mg) . 1.2.2 酶活测定法 取240 m L蒸馏水或热稳定剂溶液于三颈瓶中, 置于恒温水浴中加热, 待升到所需温度后, 加入10 m L酶液 (5 g/L) , 开始计时, 每隔一定时间取1 m L试样用显色法测定酶活. 1.2.3 失活速率及寿命测定 热稳定剂的热稳定效果由指定温度下失活速率常数 (k) 、半衰期 (t1/2) 和活化能 (Ea) 的变化来表征, 本文指定温度为80℃.其中失活速率常数越小, 半衰期越大, 活化能越大, 热稳定剂的热稳定效果越好. 失活速率常数 (k) 的测定:若为一级反应, 由速率方程ln A=-kt可求得k, 其中A是酶活, t是失活时间.半衰期 (t1/2) 的测定:指定温度下, 酶活降低一半需要的时间;活化能 (Ea) 的测定:ln k=ln k0- (Ea/RT) , 其中k是失活速率常数, T是温度. 2 结果与讨论 2.1 -淀粉酶失活动力学参数 由图1可观察到, 未加热稳定剂的α-淀粉酶呈线性失活, ln A对失活时间t作图是一条直线, 说明未加热稳定剂的酶失活符合一级反应 (R20.99) . 相关的失活动力学参数如表1所示. 由表1可知, α-淀粉酶在50℃时半衰期为12.0min, 在70℃时失活速率常数由0.056 5 min-1增大到1.082 0 min-1, 半衰期仅为1.8 min, 80℃时半衰期为0.4min, 可知温度对此酶的半衰期影响很大. 2.2 不同热剂的浓度对i-iid-淀粉酶的初始酶活性和半衰期的影响 2.2.1 最佳浓度的确定 由图2可知, 随着醋酸钙浓度的提高, 初始酶活和半衰期都先增后降, 0.001 mol/L时初始酶活最大, 0.02mol/L时半衰期最大, 这可能跟醋酸钙与酶形成了某种络合结构有关.80℃时0.01 mol/L醋酸钙将半衰期提高到89.9 min, 而且初始酶活也由原来的1.25提高到1.29, 所以选择0.01 mol/L为最佳浓度. 2.2.2 乳酸钠初始酶最佳浓度的确定 由图3可以看出, 乳酸钠浓度为0.002 mol/L时初始酶活最大, 而0.02 mol/L时却有最大的半衰期.80℃时0.02 mol/L乳酸钠将半衰期提高到167.1 min, 初始酶活由原来的1.25提高到1.48, 所以选择0.02 mol/L为最佳浓度. 2.3 添加热剂后的失运动力 2.3.1 加入醋酸钙的最适条件