DB37T 4058—2020水生动物细菌性病原检测技术规范.pdf

ICS 65.150 B 50 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 4058—2020 水生动物细菌性病原检测技术规范 Inspection protocol for bacterial pathogens of aquatic animals 2020 - 07 - 09 发布 2020 - 08 - 09 实施 山东省市场监督管理局 发 布 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。 本标准由山东省渔业标准化委员会（鲁TC03）归口。 本标准起草单位：威海海洋职业学院、山东省渔业技术推广站、中国科学院水生生物研究所、江苏 省渔业技术推广中心、威海市渔业技术推广站。 本标准主要起草人：侯仕营、刘朋、刘晓燕、李爱华、董济军、刘缵延、吴亚锋、马湘君、尹相菡、 刘振华。 水生动物细菌性病原检测技术规范 1 范围 本标准规定了水生动物细菌性病原（Bacterial pathogens of aquatic animals）检测的试剂与材 料、仪器设备、采样、细菌性病原分离培养和病原菌检测。 本标准适用于山东省水生动物常见细菌性病原检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 SC/T 7014—2006 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7201.1 鱼类细菌病检疫技术规程 第1部分：通用技术 SN/T 2123 出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范 3 试剂与材料 试剂与材料应符合GB 4789.28和附录A的规定。 4 仪器设备 按照SC/T 7201.1的规定执行。 5 采样 5.1 采样用具 应使用无菌采样用具。 5.2 采样数量、个体要求、采集部位 按照SC/T 7014—2006中第6章的规定执行。 5.3 样品运输及保存 按照SN/T 2123的规定执行。 6 细菌性病原分离培养 6.1 分离培养 6.1.1 兼性厌氧菌和需氧菌的分离培养 规范取样后，采用稀释倒平板法、涂布平板法、平板划线法等方式，在28 ℃～30 ℃培养24 h；低 温下取样应在15 ℃～18 ℃同步培养24 h。 6.1.2 厌氧菌的分离培养 将处理好的平板置于玻璃干燥器，并在其上方放置连二亚硫酸钠和无水碳酸钠（分别研细均匀，临 用前混合置于一平皿内）各30 g/1 000 mL容积，然后将干燥器盖严，用凡士林密封，在28 ℃～30 ℃培 养24 h；低温下取样则应在15 ℃～18 ℃同步培养24 h。 严格厌氧菌的分离培养应在厌氧工作台中进行。 6.2 纯培养 6.2.1 兼性厌氧菌和需氧菌的纯培养 挑取单菌落，接种于相应培养基上，按照6.1.1的方法培养。 6.2.2 厌氧菌的纯培养 挑取单菌落，接种于相应培养基上，按照6.1.2的方法培养。 6.3 多次纯培养 若经过纯培养后，未能得到形态特征基本一致的单菌落，可进行多次纯培养，直到获得形态特征基 本一致的单菌落，操作步骤应符合6.2的要求。 7 病原菌检测 7.1 病原菌16S rDNA 序列分析 7.1.1 菌落PCR 按照附录B执行。 7.1.2 结果判定 7.1.2.1 PCR 结果可靠 DNA Marker标准样品出现清晰的梯度条带，阳性对照可见1472bp左右DNA条带，且阴性