DB37T 4053—2020新城疫病毒基因VII型荧光定量PCR检测方法.docx

ICS 11.220 B 41 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 4053—2020 新城疫病毒基因 VII 型荧光 定量 PCR 检测方法 Real-time PCR assay for the detection of genotype VII newcastle disease virus 2020 - 07 - 09 发布 2020 - 08 - 09 实施 山东省市场监督管理局 发 布 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学家禽研究所。 本标准主要起草人： 孟凯、吴家强、宋敏训、袁小远、张玉霞、杨金兴、艾武、王友令、亓丽红。 新城疫病毒基因 VII 型荧光定量 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了新城疫病毒基因VII型（NDV）荧光定量PCR检测方法。 本标准适用于鸡咽喉和泄殖腔拭子及脑、肺脏、脾脏等组织中新城疫病毒基因VII型的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 试验原理 实时荧光定量PCR检测是在PCR反应体系中，除采用特异的引物外， 还加入了与DNA双链非特异性结 合的SYBR Green I荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光， 从DNA双链上释放出来时， 荧光信号急 剧减弱。随着PCR反应的进行，每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变 化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。 4 试剂或材料 除非另有说明， 在分析中仅使用分析纯的试剂，水为GB/T 6682规定的一级水。 4.1 10×磷酸盐缓冲液 PBS：pH 值 7.2。 4.2 研钵。 4.3 病毒 RNA 提取试剂盒。 4.4 SYBR Green I RT-PCR 缓冲液。 4.5 酶混合物： 内含 MLV 反转录酶和 RNase Inhibitor。 4.6 DNA 聚合酶。 4.7 阳性对照： 浓度为 1.0×105 拷贝/μL 的阳性质粒。 4.8 阴性对照： 水。 4.9 DEPC 水。 5 仪器设备 5.1 微量可调移液器：最大量程为 10 μL、20 μL、100 μL、1 000 μL。 5.2 台式高速冷冻离心机：最高转速 16 000 r/min。 5.3 荧光定量 PCR 仪：温度范围 4.0 ℃~99.9 ℃。 5.4 分析天平： 精度为 0.01 g。 5.5 冰箱： 规格为 4 ℃和-20 ℃。 5.6 二级生物安全柜。 6 引物 Forward Primer：5 ’- CAYGTCYGGAGGAAGGAGRCARAA-3 ’ Reverse Primer：5 ’-GGATGTTGRCRGCATTCTKKT-3 ’ 注： Y=C或T；R=A或G；K=G或T 7 样品 7.1 采集工具 棉拭子，剪刀， 镊子，1.5 mL离心管。 7.2 样品采集 7.2.1 咽喉拭子/泄殖腔拭子 7.2.1.1 咽喉拭子采样： 将棉拭子深入喉头来回刮 3 次，取咽喉分泌液，放于含抗生素（青霉素 2 000 U/mL+链霉素 2 mg/mL）的 10×磷酸盐缓冲液 PBS（pH 值 7.2）的 1.5 mL 离心管中。 7.2.1.2 泄殖腔拭子采样：将棉拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便（需有可见粪便），放于含抗生素（青 霉素 10 000 U/mL+链霉素 10 mg/mL）的 PBS 中。 7.2.2 组织样品 待检禽无菌采集脑、肺脏、脾脏等组织， 装入一次性采样袋或其他灭菌容器，编号。 7.3 样品运输与保存 样品放于保温箱中加冰，密封，24 h内送至实验室，如不能立即检测，需将样品放于-20 ℃冰箱保 存。 7.4 样品处理 7.4.1 咽喉拭子/泄殖腔拭子 将装有咽喉拭子/泄殖腔拭子的1.5 mL离心管在振荡器上充分混合后，取出棉拭子，4 ℃条件下5 000 r/min离心10 min，取上清液转入新的1.5 mL离心管中，编号备用。 7.4.2 组织样品 将组织置于灭菌的研钵中，按照质量体积比（1:5～10）加入灭菌PBS进行充分研磨，4 ℃条件下5 000 r/min离心10 min，取上清液转入新的1.5 mL离心管中，编号备用。 8 试验步骤 8.1 病毒 RNA 提取 提取RNA时应避免RNA酶污染。