抗肿瘤药物筛选课件.ppt

抗肿瘤药物筛选;一 细胞筛选;筛选方法 1.四氮唑蓝（MTT）还原法 原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值 ;应用：用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。 特点：灵敏度高、经济。 缺点：产物不溶于水，需被溶解后才能检测。 ;步骤： （1）制备单细胞悬液； (2)对细胞进行计数，计数后接种于96孔板，一般每孔细胞数为5000个（可先做细胞倍增试验确定每孔中最佳细胞数）； （3）将培育板放入CO2培育箱，过夜培育； （4）24h后更换培育基，并在每孔细胞中加入不同浓度药物，连续培育； （5）24或48h以后，加入MTT溶液，再培育3-6h,停止培育，弃取培育基,加入DMSO，每孔150ul，略微震荡混匀； （6）把96孔板放入酶标仪中，490nm测定吸光度。;;;CCK-8法;2.集落形成法： 测定单个细胞的增殖能力 原理：单个细胞在体外持续分裂增殖6次以上，其后代所组成的细胞群体，称克隆或集落。一般50个以上细胞，通过计数克隆形成率，定量分析单个细胞的增殖能力。 用途：抗癌药物敏感性试验，肿瘤放射生物学试验 常用方法：平板克隆形成试验，软琼脂克隆形成试验 注意：适合贴壁细胞，细胞要分散均匀，操作要严峻。 ;3.台盼蓝排斥试验 原理：台盼蓝能使死细胞着色（淡蓝色），而活细胞拒染。 活细胞总数×100 活细胞率（ ％ ）＝ 活细胞总数＋死细胞总数 注意：简洁，最常用。染色时间不宜过长。 特点：悬浮细胞较便利，贴壁细胞要进行消化，此步误差大。 ;二 微生物学筛选方法 (抗肿瘤抗生素);1.噬菌体法 噬菌体：是一类能感染微生物的病毒;（1）抗噬菌体法：干扰DNA代谢的抗生素如放线菌素、博来霉素常能抑制噬菌体在细菌细胞内的生长，从而不产生噬菌体颗粒而消灭抗噬菌体的现象。 （2）溶原性菌诱导法：除烈性噬菌体外，还有一种噬菌体，其基因组直接螯??到细菌染色体DNA，不复制，因其大部分基因功能受到了“阻遏物”阻抑，这种带前噬菌体的菌株称温和性或溶原性菌。但是当“阻遏物”的量由于细胞内或环境因子（物理、化学）而降低时，溶原性就不能维持，前噬菌体开头生长，是细菌裂解，称为诱导作用。一些抗肿瘤抗生素有诱导能力。 ;2.细菌变种法 (1)人工培育变种 如:使细菌仿照肿瘤细胞的某些代谢特点 使细菌对核酸或蛋白合成抑制剂敏感 (2)检测突变作用 如:依靠链霉素的菌株 ;3.抗代谢法;三 精原细胞法 (抗生素和植物药) 1.建立依据 B型精原细胞具有高度敏感性 2.实验方法及判定 22－28g雄性小鼠，药物直接注入睾丸，不同浓度，每一浓度用2－3只，注射3天，处死动物，睾丸固定，石蜡包埋切片，苏木精－伊红染色，显微镜观察。;四 利用分子靶点筛选 1.抑制血管生成的筛选模型 体外：血管内皮细胞培育 体内：动物眼角膜囊 地鼠颊囊 裸鼠外耳皮下 鸡胚绒毛尿囊膜;鸡胚绒毛尿囊膜模型;;对比组;;操作步骤： （1）于实验前72h孵育受精蛋 （2）实验进行前以照蛋箱透照孵育的种蛋，凡已正常发育的种蛋可照见胚胎的影子，用铅笔做记号，弃取未发育种蛋 （3）用碘酒、酒精消毒蛋壳。敲碎蛋壳把鸡胚移入平皿中，加入EagleFs培育液5-10ml，然后，可选择在鸡胚尿囊膜血管网的任何位置放置小块明胶海绵作为筛选抗血管生成药物的载体，然后加入不同浓度的血管生成抑制剂。 （4）于加药后24h、48h和72h分别在显微镜下观察药物作用结果，并照相。 （5）血管计数。可结合自动图像分析系统、摄像等技术完成 血管生成抑制率＝（对比组血管面积－药物组血管面积）/对比组血管面积×100％;2.以端粒酶为靶点的药物筛选 端粒：真核细胞染色体末端的特殊结构。功能是维持染色体稳定性。，防止染色体DNA降解，保护染色体结构基因，调节正常细胞生长。 “生命的时钟” “有丝分裂的计数器” 端粒酶功能：通过其逆转录酶活性复制和延长端粒DNA来稳定染色体DNA端粒的长度。 端粒酶活性测定方法 端粒酶抑制剂;3.细胞凋亡通路靶点 ; 细胞周期调控靶点 与侵袭相关的靶点 耐药相关的分子靶点 靶点选择原则：特异性、有效性、综合性、共性化 ;五 动物模型 整体动物实验法是评价一个药物是否有效的最主要方法 整体动物在肿瘤药理学讨论