10.体外皮肤变态反应 氨基酸衍生化反应试验方法.docx

附件10 体外皮肤变态反应 氨基酸衍生化反应试验方法 In Chemico Skin Sensitisation: Amino acid Derivative Reactivity Assay (ADRA) 1 范围 本方法规定了氨基酸衍生化反应试验方法的基本要求和方法。 本方法适用于已知单一组分、已知组成成分的多组分化妆品用原料潜在致敏性的评价。 2 试验目的 预测和评价化妆品用化学原料是否具有潜在皮肤致敏性。 3 定义 3.1 氨基酸衍生物消耗百分比Percent Amino acid Derivative Depletion 与溶剂对照相比，受试物消耗氨基酸衍生物的程度。 3.2 共洗脱 Co-elution 受试物在281 nm处吸收显著，并与氨基酸衍生物保留时间相同或色谱峰部分重叠，干扰氨基酸衍生物定量分析。 4 试验原理 有致敏性的受试物与N-（2-（1-萘基）乙酰基）-L-半胱氨酸（NAC）和N-（2-（1-萘基）乙酰基）-L-赖氨酸（NAL）模拟的皮肤蛋白进行反应，消耗氨基酸衍生物。测定衍生物的量，计算氨基酸衍生物消耗百分比，从而判断受试物是否具有皮肤致敏性。 5 试验材料与试剂 5.1 氨基酸衍生物片段与纯度 N-（2-（1-萘基）乙酰基）-L-半胱氨酸（NAC）：分子式C15H15NO3S，分子量289.35，纯度：＞98%。 N-（2-（1-萘基）乙酰基）-L-赖氨酸（NAL）：分子式C18H22N2O3，分子量314.38，纯度范围：＞98%。 图1 NAC（左）和NAL（右）的结构式 5.2 阳性对照与受试物的配制 阳性对照溶液：取苯乙醛适量（纯度＞90%），加乙腈制成1 mmol/L的溶液，临用新制。 受试物溶液：溶剂选用蒸馏水、乙腈和丙酮，单一或混合使用制成1 mmol/L的溶液，临用新制。如出现溶解不完全的情况，可将受试物先溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，然后用乙腈稀释该溶液制备成1 mmol/L受试化合物溶液。最终溶液中DMSO用量不得超过5%（V/V）。 反应固定液：1 mL三氟乙酸（TFA）加40 mL水于5 mL离心管中，得到2.5% TFA水溶液。 5.3 氨基酸衍生物贮备液的配制 5.3.1 N-（2-（1-萘基）乙酰基）-L-半胱氨酸（NAC）贮备液：称取适量NAC，用pH 8.0的磷酸盐缓冲液配制成6.667 μmol/L的溶液。储备液应在-80 ℃下冷冻保存，存放时间不超过六个月，每次使用应验证其稳定性。 pH8.0磷酸盐缓冲液：取0.18 g无水磷酸氢二钠与4.02 g无水磷酸二氢钠溶于300 mL蒸馏水当中，每300 mL缓冲液加入1 mL的0.1 mmol/L EDTA溶液，混合均匀，测终溶液pH在7.9-8.1之间，配制完成，每次使用前检查pH。 5.3.2 N-（2-（1-萘基）乙酰基）-L-赖氨酸（NAL）储备液：称取适量NAL，用pH10.2的磷酸盐缓冲液配制6.667 μmol/L的溶液。储备液应在-80 ℃下冷冻保存，存放时间不超过六个月，每次使用应验证其稳定性。 pH10.2磷酸盐缓冲液：取4.26 g无水磷酸二氢钠溶于286 mL蒸馏水，加入14 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，每300 mL缓冲液加入1 mL的0.1 mmol/L EDTA溶液。搅拌均匀，测终溶液pH在10.1-10.3之间，配制完成，每次使用前检查pH。 5.3.3 氨基酸衍生物标准线性溶液的配制 NAC标准线性溶液的稀释溶剂：取15 mL pH8.0磷酸盐缓冲液于50 mL离心管，加1 mL水、100 μL三氟乙酸、3.9 mL乙腈，振荡混匀，临用新制。 NAL标准线性溶液的稀释溶剂：取15 mL pH10.2磷酸盐缓冲液于50 mL离心管，加1 mL水、100 μL三氟乙酸、3.9 mL乙腈，振荡混匀，临用新制。 先配制5 μmol/L的标准溶液（std7）：300μL 6.667 μmol/L NAC储备液加入1.5 mL离心管中，加入20 μL水、2 μL三氟乙酸、78 μL乙腈。 标准线性溶液：取std7溶液，逐步稀释到下表浓度。std1为稀释溶剂。NAL线性溶液操作步骤与NAC一致。 表1 线性点的摩尔浓度 序号 Std1 Std2 Std3 Std4 Std5 Std6 Std7 浓度μmol/L 0.000 0.15625 0.3125 0.625 1.250 2.500 5.000 5.3.4 液相待测溶液的配制 共洗脱对照：150 μL磷酸盐缓冲液+50 μL受试物溶液。 参比溶液A和B：150 μL NAC+50 μL 乙腈，平行样A三份B六份。NAL的操作步骤一致。 参比溶液C：150 μL NAC+50 μ