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gnrh和gnrhr在青山羊下丘脑内的分布 促性腺激素释放激素（gnrh）是脉冲脑瘫产生的一种十羟神经激素。它与前叶促性腺激素细胞中的促性腺激素释放激素受体（gnrh）结合，促进fsh和lh的分泌，保持刺激性发育和繁殖机制。1971年首次从猪和羊下丘脑内提纯出GnRH。近年来,国内外学者应用免疫细胞化学技术,就GnRH免疫阳性细胞在猪、山羊和杂交水牛等下丘脑的分布多有研究,但对生后发育阶段下丘脑中GnRH及其受体免疫阳性细胞的分布和变化规律的研究迄今未见文献报道。分布于鲁西南地区的济宁青山羊是典型的性早熟品种,母羊初情期始于2月龄,3~4月龄即性成熟。为揭示GnRH及GnRHR在生后发育阶段对性发育的调控机理,笔者对济宁青山羊下丘脑各主要核团内GnRH及GnRHR在生后发育时期的形态学变化及分布规律进行了研究,旨在为揭示济宁青山羊性发育、性早熟以及高繁机理提供基础性资料。 1 材料和方法 1.1 青山羊及其羊肉干的细胞生物学检测 选购2~3岁、体质量24~26 kg的健康雌性济宁青山羊40只(购自山东科龙畜牧产业有限公司济宁青山羊原种场),同期发情处理并人工授精使之妊娠(精液来自2~3岁,体质量30~32 kg的济宁青山羊公羊)。济宁青山羊羔羊按出生(0月龄)、初情期(2月龄)、性成熟(4月龄)和性成熟后(6月龄)分为4组,每个年龄组选取体质量相近的6只宰杀。母羊与羔羊均采用舍式饲养。 羔羊放血致死后,立即将脑置入Bouin’s固定液。在乳头体和视交叉之间取下丘脑,经流水冲洗12 h,梯度酒精脱水,二甲苯透明,浸蜡包埋,连续切片,片厚10 μm,切片粘贴在经多聚赖氨酸处理的载玻片上。将切片分为3套,1套用于GnRH及GnRHR的免疫组织化学SABC法染色;1套做HE染色形态学观察并定位核团;1套做阴性对照。核团定位参照《大鼠脑立体定位图谱》和《Netter’s Atlas of Human Neuroscience》。 1.2 血清dab试验 (1)在37 ℃恒温箱内烤干的石蜡切片经二甲苯脱蜡,梯度酒精水化,室温条件下3% H2O2孵育30 min,蒸馏水洗3次。(2)胰酶(北京中杉金桥生物科技公司)按1∶5稀释后,37 ℃恒温箱内修复10 min。蒸馏水洗3次。(3)山羊血清按1∶10稀释后,37 ℃恒温箱封闭30 min。(4)甩去封闭液,滴加GnRH及GnRHR一抗(1∶200,北京博奥森生物科技公司),4 ℃过夜。(5)复温后,PBS洗3次,每次10 min。滴加生物素标记的羊抗兔IgG(1∶200,北京博奥森生物科技公司),37 ℃恒温箱内孵育1 h,PBS洗3次,每次10 min。(6)加入辣根过氧化物酶-链霉素亲和素(1∶200,北京博奥森生物科技公司),37 ℃恒温箱内孵育30 min,PBS洗3次,每次10 min。(7)DAB试剂盒显色(北京中杉金桥生物科技公司)1~5 min,蒸馏水洗涤终止显色。(8)苏木素轻度复染,脱水,透明,封片。 阴性对照组用正常山羊血清封闭液代替一抗,其余步骤同上。 1.3 显微镜头检测细胞系统 根据下丘脑各核团在空间立体结构上分前-中-后3部分的特点,在连续切片中依次随机抽出10张切片(确保包含各个核团的前-中-后3部分),采用Olympus BX41(DP25)显微摄像系统拍照,并用Photoshop计数软件辅助计算每张切片各核团内阳性细胞总数。40×物镜下每张免疫组化染色切片中相同核团随机选取10个不同部位拍照,用美国Media Cybernetic公司生产的Image-Pro-Plus图像分析软件(Version 5.0)进行阳性细胞面积分析。 1.4 单因子方差分析 免疫组化图像分析所得的数据用Excel 2003进行统计,数据以“平均值±标准误(Mean±SE)”表示,用SPSS 17.0进行单因子方差分析(one-way ANOVA)和t检验。 2 结果 2.1 gnrh阳性细胞的变化 下丘脑各核团内均可见GnRH免疫阳性细胞,阳性物质呈棕色或棕黄色,分布在胞质内。胞核为浅蓝色,位于细胞中央或一侧,背景无色或淡黄色。0月龄时各核团阳性细胞多呈圆形和卵圆形;2~6月龄阶段各核团阳性细胞呈不规则的圆形、梭形或三角形,阳性细胞的突起染色相对较浅。0~2月龄阶段阳性细胞突起少,阳性神经纤维稀疏(图1和图2);4~6月龄阶段阳性细胞突起增多且明显,阳性神经纤维的密度增大(图3和图4)。阴性对照呈淡蓝色。 各核团GnRH阳性细胞数均随月龄增长而增大。0~2月龄时各核团GnRH阳性细胞数增长迅速(P0.01);2~4月龄阶段除室旁核外,乳头体核和结节内侧核的增大差异极显著外(P0.01),其余核团内阳性细胞的大小无明显变化(P0.05);4~6月龄阶段视上核阳性细胞显著增大(P