假狂犬病毒不同亚核内的分布特点及其与pvn内avp位置配布的关系.docx

假狂犬病毒不同亚核内的分布特点及其与pvn内avp位置配布的关系 神经系统与神经系统和分泌系统在结构和功能上密切相关，共同形成一个多功能的“神经——内源性和侧支性”调节网络。中枢神经系统通过神经途径(neuro-pathway,即神经纤维对免疫器官的直接支配)和体液通路(humoral-pathway, 即通过多种体液因子如激素、神经肽等作用于免疫细胞)调节机体的免疫功能。电生理、脑毁损及脑室应用免疫刺激剂等研究证实:大脑对免疫功能的调控是多部位、多核团协调作用的结果,特别是下丘脑室旁核(paraventricular nucleus of hypothalamus, PVN)在神经免疫内分泌的调控中起整合中心的作用。但有关PVN对某一免疫器官的直接神经调控的研究国内外尚未见报道。假狂犬病毒(pseudorabies virus, PRV)能沿特意的神经通路跨突触感染,并可用免疫组化法显示被PRV感染的第二级、第三级以上神经元。本课题组曾观察了脾脏注射PRV 72 h后支配脾脏的第一级、第二级和第三级神经元在腹腔神经节、脊神经节、脊髓及脑干内的分布,本研究着重观察脾脏注射PRV 96 h后PRV标记神经元在PVN不同亚核内的分布特点及其与精氨酸血管加压素(arginine vasopressin,AVP)神经元位置配布间的相互关系,以探讨不同亚核在调控脾脏免疫功能中所起的作用。 1 材料和方法 1.1 大鼠林场中pb的表达 成年雄性SD大鼠4只(体重250～280 g,华西医科大学实验动物中心提供),戊巴比妥钠腹腔麻醉(40 mg/kg)下用微量进样器在脾被膜下注入PRV 35～50 μL,实质内注入5～10 μL,大鼠存活96 h后再次在深麻醉下经心脏至升主动脉插管依次灌注0.9%NaCl(37 °C)250 mL和含15%饱和苦味酸的4%多聚甲醛固定液(0.1 mol/L PB pH 7.4, 4 °C)250 mL,灌毕取脑、脾、脊髓、脊神经节和腹腔节入上述固定液后固定24 h,再转入20%蔗糖液(0.1 mol/L PB pH7.4配制)过夜,恒冷箱冰冻冠状连续切片(片厚40 μm),分5组收集于0.01 mol/L PBS中。 1.2 免疫组化法检测cap、aa也-m,kh-pcp的表达 假狂犬病毒(PRV, bartha株,滴度为 5×108pfu/mL plage forming units)和兔抗PRV血清 ( DP133,1∶4 000 ) (均由美国费城宾州大学动物生物学系Miselis 教授馈赠); ABC kit (Vector公司);兔抗AVP血清(1∶8 000 Vector公司)。每相邻2组切片分别作以兔抗PRV血清和兔抗AVP血清为一抗的免疫组化ABC法染色,主要过程为切片经10%正常羊血清—0.3%TritonX-100室温孵育30 min,一抗37 °C孵育2 h,室温过夜,再分别经Biotin-lated IgG (1∶200) 37 °C 90 min和ABC (1∶100) 37 °C 2 h后,DAB呈色。以上各步骤间均用0.01 mol/L PBS (pH7.4 )漂洗5 min×3次。裱片,常规脱水、透明、封片后镜检、摄片。另一组切片,分别以PBS和正常兔血清代替PRV及AVP作对照染色。 1.3 prv感染细胞在pvn领域的计数结果 每例动物随机选取一组含室旁核的间脑切片,计数4例动物室旁核喙段、中段和尾段内PRV阳性细胞的总数;用点测格计数各例动物各该段内PRV阳性细胞所在区域内的总测点数,根据公式a (p) = p总×a点[a (p)为总面积,p总为总测点数,a总为每点所占面积]计算出室旁核喙段、中段和尾段内PRV阳性细胞分布区的总面积,最后以各项指标的均数代表本实验中PRV感染细胞在PVN内的数量和分布特点。 2 结果 2.1 prv感染神经元的分布 脾脏内注射PRV 96 h后,除了在腹腔神经节、脊神经节、脊髓侧角中间外侧柱、延髓迷走神经背核内追踪到跨突触感染的PRV阳性神经元外,还在下丘脑室旁核(PVN)整个核团范围内观察到PRV感染神经元,核团尾段细胞数量明显多于喙段(见表1),喙段的少量感染神经元又主要集中于前小细胞亚核(anterior parvocellular,AP)区域(见图1);尾段的PRV感染神经元主要分布在外侧小细胞亚核(lateral parvocellular,LP)和尾侧大细胞亚核(posterior magnocellular,PM)区域(见图2 );中段仅有少数PRV感染细胞散在分布于背侧小细胞亚核(dorsal parvocellular,DP)内(见图3);PVN全长相对应的室周核内(periventricular parvocell