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严重创伤后早期下丘脑cfos与crh1r的变化 虽然已对严重伤口后的应激反应（crh）的重要作用达成一致，但对引起重视的下肢crh受体的形成和调节机制尚不清楚。为此,本组以大鼠右肺中部重度创伤合并右股骨中段骨折为模型,探讨严重创伤后大鼠下丘脑CRH1R与c-fos蛋白表达变化,为创伤后应激反应的进一步研究和防治提供参考。 材料和方法 1 实验和撞击大鼠右脑并病 选成年(4个月)Wistar雄性大鼠,体重(240±10)g。随机分组,大鼠分笼饲养(3只/笼)于设定温度和定时光照(光照8:00~20:00)的房间,食物和水可自由摄取。饲养1周后,实验均在10:00~12:00开始。用质量浓度为30g/L戊巴比妥钠腹腔注射(20mg/kg),BIM-Ⅲ型生物撞击机撞击大鼠右胸第四肋,计算机调节高压气舱压力为500kPa,动物右胸部距弹道出口1cm,撞击后立即用台钳折断右侧股骨中段。参照人多发伤标准,此伤情为重度多发伤。分别在撞击前,撞击后15、30分钟、1、2、6和12小时致死动物,在解剖显微镜下分离下丘脑(视交叉、乳头体为前、后界,左右下丘脑沟为侧界,深约1~1.5mm,除去脑膜及血凝块),立即置液氮中保存。 2 织物的染色结果 采用常规SABC法,取各时相点脑片采用漂浮法,显色采用硫酸镍胺增强染色,阳性结果为紫蓝色反应物。对照实验用PBS代替一抗,结果为阴性。 3 蛋白浓度的测定 提取大鼠下丘脑组织蛋白,并定量。自液氮中取出组织分装于EP管中,每克组织加缓冲液1 ml。-20℃冻存组织20分钟后,以12 000r/min,4℃离心20分钟。上清液移至另一EP管(100μl/管)中,置100℃水中,6分钟。于试管中加考马斯亮蓝染液3ml和蛋白上清液5μl,混匀后测定蛋白浓度。每EP管加等量加样缓冲液(100μl),根据蛋白浓度计算所需上样量(注:以上操作均在冰板上进行)。聚丙烯酰胺变性凝胶分离蛋白(上样量为40μg总蛋白),电转膜法将蛋白转移到硝酸纤维膜上,封闭、加一抗(稀释1:1000)、辣根过氧化物酶标记二抗(稀释1:1000),化学发光试剂增强反应,X线胶片压片曝光,凝胶成像系统分析结果,设对照并重复3次。 4 统计处理 实验数据以均数±标准差表示,分别进行t检验和方差分析。 crh1r在正常情况下表达情况 免疫印迹(Western bolt)结果经凝胶成像系统分析光密度值(Odu/mm2): 下丘脑c-fos蛋白含量在正常对照组含量较低,在创伤后30分钟即刻增加达高峰,随即迅速下降,至12小时降至最低(图1)。 免疫组织化学: 在正常情况下有少量的CRH1R分布于下丘脑室旁核(PVN)的神经元的胞浆,严重创伤后1小时,下丘脑PVN、SON神经元显著着色深染(图2)。 Western blot结果显示,严重创伤1小时后,CRH1R表达明显增加,创伤后6小时开始回落,创伤1小时后各组与对照组比较差异非常显著; CP-154526可明显抑制创伤后下丘脑神经元CRH1R蛋白表达增加,创伤1小时后各组与对照组比较差异非常显著(图3)。 c-fos与crh1r表达的关系 CRH是一种含41个氨基酸的肽,与机体的内分泌、生理机能、神经化学和行为反应密切相关。虽然CRH广泛表达于中枢神经系统(CNS),但在急性应激后仅在下丘脑表现CRH转录活性增加。急性应激引起杏仁核(CeA)和室旁核(PVN)的CRH mRNA增加。c-fos属于早期快速激活反应基因,c-fos可作为细胞代谢水平的标志,可激活神经元,c-fos mRNA编码核蛋白fos,而调节靶基因的转录,认为c-fos在神经元功能持续激活中起重要作用。c-fos的 表达和目的基因是否有直接的因果关系依赖于在基因的激活区是否都有一功能一致的序列。神经递质、神经生长因子、钡、钾引起培养细胞去极化都可快速诱导c-fos表达,而在动物实验中,如出血、高渗钠注射后,c-fos表达也表现为迅速地增加及随后快速地回落,推测可能是由于c-fos表达的增加对其自身的基因表达有抑制作用,因此,c-fos的诱导作用是快速和短暂的。新近的研究表明,在调节CRH基因表达的促进剂中,存在几种AP-1序列,而Fos/Jun结合和调节这些基因。实际上,应激后许多其它编码基因的表达,如酶、受体或其它蛋白等可能也受c-fos的调节。以往的实验表明,在脑室内注射CRH后c-fos阳性表达可激活神经细胞,在下丘脑选择性的上调CRH基因的表达。 在创伤后应激反应中,CRH在协调内分泌、生理机能和行为反应中发挥关键作用。虽然在创伤后应激反应中下丘脑CRH表达明显增加,但对创伤后下丘脑c-fos和CRH1R表达之间的相互关系知之甚少。因此,本研究探讨了创伤后下丘脑c-fos与CRH1R表达及变化关系。在本实验中Western