免疫学检测与抗体技术.ppt

2．人源化抗体 将鼠抗体的互补决定区(CDR)与人IgFR和C连接构建“人源化抗体”。 (1) 模板替换:使用与鼠对应部分有较大同源性的人FR替换鼠FR区,例如可通过CDR移植构建“改型抗体” (2)表面重塑:对鼠CDR及FR表面残基进行重塑或镶饰,使之类似于人抗体CDR的轮廓或人FR的型式。 (3)补偿变换:在人FR选择与CDR有互补作用、与抗体的亲和力有密切关系或对FR空间结构折叠起关键作用的残基进行改变,以补偿完全的CDR移植 (4)定位保留:通过计算机模建从现有的人源抗体保守序列中搜寻与鼠FR区最类似的序列,根据最简位置模板确定鼠可变区的关键位置残基,并保留所有这些位置而将其余部分进行人源化。 第二十九页，共四十六页，2022年，8月28日 3.小分子抗体 (1)ScFv：由VH和VL中间连以14?15个小肽,常用的连接肽为(Gly4Ser)3 (2)VH与VL适当部位各引入一个半胱氨酸形成以二硫键固定的Fv段而构成的DsFv (3)将ScFv中两个可变区之间的接头缩短,使两分子间VH和VL配对形成双价小分子抗体(Diabody) (4)将两种不同特异性的V基因交叉配对,则可得到双特异性Diabody (5)在ScFv的一端加上一个双聚化结构亦可构建不同类型的双价或双特异性小分子抗体,如Minibody等 第三十页，共四十六页，2022年，8月28日 (二)抗体库技术 (三)产生嵌合抗体的小鼠和产生人抗体的小鼠 利用基因打靶和取代的方法以及转基因技术产生嵌合抗体。 通过转基因、基因缺失及杂交和选择等一系列过程，获得双转染基因(人H、?链基因)的纯合小鼠。其脾、淋巴结、骨髓中的B细胞可表达人的??链。 第三十一页，共四十六页，2022年，8月28日 (四)细胞内抗体 *细胞内抗体是指在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体,亦称为内抗体(intrabody)。 *若在抗体基因的N端或C端加入引导序列就能使抗体表达定位亚细胞部位,如胞浆、线粒体、内质网或细胞核部位。 *若在细胞内表达特异识别与肿瘤发生有关的癌基因编码的抗体,即可抑制癌基因编码产物的表达,可用于肿瘤的治疗。 *细胞内免疫用于病毒性疾病的治疗 *抗EGFR胞外区的ScFv-R IR,并在ScFv-R IR的C-末端连接KDEL肽,提供ER滞留 第三十二页，共四十六页，2022年，8月28日 (五)基因工程抗体衍生技术 1．双特异性抗体(BsAb)或称双功能抗体(BfA)。 2. 抗体的抗原化技术：借助人源化抗体的构建方法，以抗体V区作为分子载体来表达生物学相关的多肽或外源性抗原表位，即抗原化抗体(antigenized antibody,AbAg)。 3．抗体重组免疫毒素 4.催化抗体(catalytic antibody)或抗体酶(abzyme)：将催化活性引入抗体的结合部位,产生一种具有抗体和酶双功能的蛋白质,称为抗体酶或程序性酶(programmable enzyme)。 第三十三页，共四十六页，2022年，8月28日 免疫学检测与抗体技术 第一页，共四十六页，2022年，8月28日 一、概述 免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手段及分子生物学技术在免疫学研究中的应用。 ? 免疫学技术的应用极为广泛,疾病的诊断、疗效评价及理论研究等。 二、抗原抗体的检测技术 *根据反应的基本原理与表现主要分为凝集反应、沉淀反应和补体参与的各种反应 *根据抗原抗体反应设计的试验还有标记抗原(或抗体)检测相应物质的标记技术。 第二页，共四十六页，2022年，8月28日 对机体参与免疫应答的细胞进行鉴定,计数及功能测定 (一)细胞计数 1. 荧光抗体染色 2. 免疫酶染色技术: *ABC法 *APAAP法 3. 免疫金银染色法(IGSS) 4．免疫细胞化学法 5．四聚体法 6．TCR?链测定 三、免疫细胞的检测 第三页，共四十六页，2022年，8月28日 (二)免疫细胞功能的测定 1. T细胞功能测定：肿瘤，病毒感染，免疫缺陷，自身免疫病等 (1)细胞增殖(转化)试验：可分为非特异性丝裂原和特异性抗原两类。 *丝裂原主要有PHA、Con A和PWM； *抗原刺激物有破伤风类毒素、PPD和白色念珠菌等； *同种MHC及抗CD3单抗等 *肿瘤细胞