下丘脑-垂体-卵巢轴促性腺激素释放激素在去卵巢时的表达及电针处理对自然代偿大鼠的影响.docxVIP

下丘脑-垂体-卵巢轴促性腺激素释放激素在去卵巢时的表达及电针处理对自然代偿大鼠的影响 临床上，采用针灸治疗两侧卵巢切除术和更年期综合征，取得了明显的疗效，可以完全取代西医的“激素替代疗法”。然而,也有临床报道,“围绝经期综合征”患者体内的雌激素水平降低,出现诸如潮热出汗、易怒烦躁、心悸、失眠等症状,在发病6～12个月后,大部分人不经治疗,临床症状会有所改善,血雌激素水平也逐步回升。提示人体生殖内分泌系统可能存在一种自然代偿的机制。另外,有文献报道,母羊被切除单侧卵巢后,排卵率显著升高,也提示机体在生殖功能方面,存在有自然代偿的机制。我们以往研究结果表明,在去卵巢导致HPOA功能异常的大鼠模型上,电针一组穴位3次后,动物阴道涂片中,上皮细胞成熟脱落现象重新出现,血雌激素水平也随之升高,下丘脑内出现GnRH在PVN的异位表达,并且有GnRH与CRH共存于同一个神经元中。电针的这种作用与妇女长期患有“围绝经期综合征”后,出现的自然代偿非常相似。为此我们提出了以下设想:针刺处理后,大鼠下丘脑内出现GnRH在PVN的异位表达,是电针特异的作用,还是卵巢功能衰退后,经过一定的时间,机体本身会启动一种潜在的代偿机制,以补偿本身的HPOA功能低下,而电针处理可能提早启动了这一自我代偿的进程,本文将就这些问题进行了探讨。 1 材料和方法 1.1 阴道缺失菌株的检测 雌性Sprague-Dawley 大鼠,45日龄左右,180～200 g,购自复旦大学实验动物中心。饲养于12 h光照/12 h黑暗的环境中,自由摄食和饮水。经阴道涂片观察阴道脱落细胞存在典型的4天周期性变化者,在实验环境中适应一星期后进行实验。动物的处理符合国际实验动物使用规则。 1.2 阴道涂片检查 动物随机分为正常组( INT)、去卵巢组(OVX)、自然代偿组(OVX3M组、OVX4M组、OVX5M组、OVX6M组)以及去卵巢加电针组(OVX+EA),每组6只大鼠。OVX 动物在乙醚麻醉下作双侧卵巢切除术,术后与INT 动物在相同条件下喂养1个月后,连续3 d作阴道涂片检查,涂片中未见到成熟脱落上皮细胞作为卵巢切除成功的指标。此时给予电针组以电针,选取腹部穴位“关元”(RN4)、“中极”(RN3)、双侧“子宫”(EXCA1)以及下肢穴位“三阴交”(SP6),采用连续波,刺激频率3 Hz,强度2 mA(G6805-Ⅱ型电针仪,上海医用器材厂生产),每天1次,连续3天。末次电针后6 h,将OVX+EA与INT及OVX动物同时灌注处死。自然代偿组动物分别于去卵巢之后3个月、4个月、5个月、6个月时处死,进行后续实验。 1.3 大鼠尾动脉取血、分离、测定 处死前分别于OVX组、自然代偿(OVX3M、OVX4M、OVX5M 以及OVX6M)组以及OVX+EA组大鼠尾静脉取血,INT大鼠于动情间期取血。血样品在室温放置2 h,3 000×g离心20 min,分离出血清,-70 ℃保存备用。雌二醇RIA 药盒由上海生物制品研究所生产。按说明书进行操作。本方法的最小检测量小于10 pg/mL。 1.4 gnrh和兔抗大鼠crh的染色 动物电针组给予电针后6 h以及非电针组,经7%水合氯醛麻醉后,常规灌注固定。下丘脑部分制成30 μm 厚的连续冠状位冰冻切片,用于H.E.、免疫组化染色及免疫荧光双标记染色。小鼠抗大鼠GnRH和兔抗大鼠CRH多克隆抗体为第一抗体,购自美国Chemicon及Santa Cruz公司,工作浓度分别为1∶500,1∶100 。脑片在第一抗体液中,于37 ℃分别孵育3 h 和2 h,4 ℃72 h和48 h。常规封固。阴性对照分别用正常小鼠血清和0.01 M PBS(pH 7.4)代替第一抗体,正常羊血清代替第二抗体,进行免疫组化实验,作阴性对照。 1.5 tritc-淮山抗兔的诱导诱导表达 脑片于1%Triton-x100中孵育10 min,漂洗3×5 min;后入封闭液中37 ℃孵育30 min;入GnRH和CRH一抗中,浓度分别为1∶300和1∶100,37℃孵育3 h,4 ℃ 72 h;加入TRITC-山羊抗兔IgG(1∶100)和FITC-山羊抗小鼠(1∶100)(购自Jackson公司)混合液,37℃孵育2 h,漂洗3×30min;90%甘油封片。激光共聚焦显微镜(CLSM,德国Leica公司)扫描并记录。 2 结果 2.1 大鼠血民法2的表达 大鼠切除卵巢后1 个月,血E2水平显著下降,去卵巢后3 个月血E2水平为(16.72±3.19) pmol/mL,开始逐渐上升,4 个月时为(28.10±8.88) pmol/mL,明显升高,至6个月时为(31.12±6.61) pmol/mL。电针后大鼠血E2水平为(27.04±3.93) pmol/mL ,相当于