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200920092010年部分猪场猪主要传染病流行病学调查 云南养猪业的发展水平相对滞后。随着其他省份先进的生产技术和管理理念的不断学习，云南养猪业取得了很大进步，但食品疾病的控制和诊断仍是云南养猪业发展的瓶颈。由于规模化高密度的饲养,集约化经营,致使接触性传染性疫病发病增多,危害严重。发病混合感染、继发感染、并发感染增多,必须经过临床诊断、病理剖检和实验室诊断结果综合分析后才能正确做出诊断。如猪瘟、猪大肠杆菌病等旧病依然存在,同时,如猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌等新的疫病也不断涌现。免疫抑制性疾病的危害日渐严重。以繁殖障碍为主的传染病普遍存在,而且病因多样。呼吸道疾病日益突出。细菌性疾病发病率增高,治愈率低。疫病的非典型化,病毒毒力的增强与减弱,细菌耐药性变异,导致旧病以新的面貌出现,从2009年4月到2011年1月对送检样品根据临床症状、病理剖检和流行病史确定实验室检测项目,进行实验室诊断,最终统计其阳性检出,为未来云南省常见猪传染病防治措施提供流行病学依据。 1 材料和方法 1.1 试剂与检测试剂 PCR仪、酶标仪、凝胶成像系统购于BioRad公司,台式离心机购于Thermo Hybaid,高速冷冻离心机为HITACHI CF16RXⅡ型。Trizol试剂购于大连宝生物工程有限公司。M-MLV Reverse Transcriptase反转录酶购于Promega。组织、细胞、细菌、酵母基因组DNA纯化试剂盒,血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒购于TIANamp Genomic。DNA Kit购于TIANGEN公司。EasyTaqTMDNA Polymerase购于Trans Gen Biotech。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。猪瘟抗原ELISA试剂盒,猪繁殖与呼吸综合征抗原ELISA试剂盒和猪伪狂犬病病毒gp1抗体检测试剂盒(ELISA)购于IDEXX LABORATORIES。支原体抗体ELISA试剂盒购于深圳市某生物科技有限公司。弓形虫间接血凝(IHA)抗体检测试剂盒购于兰州兽医研究所。细菌生化鉴定糖发酵管购于杭州天和微生物试剂有限公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 1.2 方法 1.2.1 治疗药物治疗用药 询问畜主养殖规模、地点、病史、疫苗接种情况和治疗用药等。对病例可视黏膜、体温、皮肤、下痢、精神状态等进行观察记录,而后对病例进行无菌采样和病理剖检。 1.2.2 制备监狱细菌、固血装置 前腔静脉无菌采血,4 ℃保存。用于检测抗体的全血样品,4000 r/min离心10 min,取上清分装无菌EP管,-70 ℃保存。用于细菌、支原体、附红细胞体检测的病料、血样、分泌物4 ℃保存。动物腋下动脉放血至死,病理剖检,无菌条件采取主要病变器官病变部位,-70 ℃冻存。送检病料无菌Eppendorf管分装后,-70 ℃冰箱冻存。 1.2.3 pcr检测dna感染 1.2.3.1实验室检测方法 实验室检测方法见表1。 1.2.3.2疑似病料检测方法 疑似RNA病毒病病料(CSFV、PRRSV)RT-PCR检测方法(吴鑫等,2008)和DNA病毒病病料(PRV、PCV、PPV)的抗原PCR检测方法(李进涛等,2009)。 1.2.3.2.1引物设计 根据NCBI上已发表的病毒cDNA、DNA代表株的序列(李鹏等,2010;杨玉艾等,2010;曾少林等,2010),设计以下引物(表2)。 1.2.3.2.2疑似RNA病毒感染的病料组织总RNA提取与反转录 取含毒量高的病料组织0.1 g,加入200 μL PBS快速研磨后,加入Trizol 800 μL,充分混匀,接下去操作按Trizol使用说明进行。用30 μL RNase DNase-free水溶解RNA。在50 μL反应体积中,加入23 μL RNA,4 μL通用引物Oligo dT(10 mmol/L),混匀,70 ℃作用5 min,冰浴2 min。依次加入以下物质:10 mmol/L dNTP 2.5 μL,M-MLV 5×RT Buffer 10 μL,RNase抑制剂(40 U/μL) 1 μL,M-MLV反转录酶(5 U/μL) 2 μL,加ddH2O至50 μL混匀。42 ℃反应1 h,37 ℃反应10 min,4 ℃冷却备用,-20 ℃保存。 1.2.3.2.3疑似DNA病毒感染的病料组织及血液总DNA提取 取含毒量高的病料组织0.1 g,加入1 mL灭菌PBS洗液,充分研磨,以下步骤参照组织、血液全DNA提取试剂盒说明书的方法进行。用30 μL RNase DNase-free水溶解DNA,4 ℃冷却备用。-20 ℃保存。 1.2.3.2.4反应体系及PCR循环参数 10×EasyTaqTMBuffe