分子生物学研究法(上)——DNARNA及蛋.pptVIP

;基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学讨论的核心技术。 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。 事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区分于其它生命科学技术的根本特征。;5.1 基因操作的基本工具;重组DNA实验中常见的主要工具酶;（二）基因克隆的载体 载体三要素： 自我复制能力 携带外源基因片段大小 插入位点多少 大肠杆菌质粒载体： 1、pSC101质粒载体 长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及EcoR I、Hind III、BamH I、Sal I、Xho I、Pvu II以及Sma I等7种限制性核酸内切酶的单酶切位点，在Hind III、BamH I和SalI等3个位点插入外源基因，会导致tetr失活。 是第一个真核基因克隆载体。缺点：它是一种严紧型复制掌握的低拷贝质粒，平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101 DNA，产量很低。;2、ColE1质粒载体 松弛型复制掌握的多拷贝质粒。 一般情况下，当培育基中氨基酸被耗尽，或是在细胞培育物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。 松弛型质粒DNA却连续复制数小时，使每个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到1000~3000个，占细胞总DNA的50%左右。 ColE1质粒DNA复制起始部位调控因子之间关系 前体RNA(RNAII)的转录起始于复制起点上游，需经RNaseH加工后产生有555个核苷酸的引物，起始DNA合成。 RNAI在RNAII的5’末端，转录方向相反，因此能通过氢键配对与后者相互作用，阻止RNaseH加工RNAII，使其不能转化为有活性的引物，阻碍复制起始。 没有Rop蛋白，RNAI基因就不能起始转录。 ;3、pBR322质粒载体 由三个不同来源的部分组成的： 第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（AmpR）； 其次部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）； 第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。 优点是具有较小的分子量(4363bp)，易于纯化。即使携带了6-8kb的外源DNA片段，操作仍较便利。 有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记。 有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增，每个细胞可累积1000~3000个拷贝，便于制备重组体DNA。;4、pUC质粒载体（包括四个部分）： 来自pBR322质粒的复制起点（ori） 氨苄青霉素抗性基因（ampr） 大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）启动子及编码α-肽链的DNA序列。特称为lacZ’基因 位于lacZ’基因5’-端的一段多克隆位点（MCS），外源基因插入破坏lacZ ’基因功能 优点： 更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点， 其分子小了很多，pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。由于缺失rop基因，pUC质粒不经氯霉素扩增时， 平均每个细胞即可达500~700个拷贝。;LacZ编码β-半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸的α-肽，IPTG（异丙基- β-D-硫代半乳糖苷）诱导该基因表达，所合成的β-半乳糖苷酶α-肽与宿主细胞编码的缺陷型β-半乳糖苷酶互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶，水解培育基中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），生成蓝色的溴氯吲哚。 含X-gal培育基中非转化菌落呈蓝色，含有重组DNA分子的菌落为白色。 pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的α-肽链可参加α-互补作用。因此，可用X-gal显色法实现对重组体转化子的鉴定。 具有多克隆位点MCS区段，可以把具两种不同粘性末端（如EcoR I和BamH I）的外源DNA片段直接克隆到pUC8质粒载体上。;5、pGEM-3Z质粒 长度为2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ基因。 含有两个噬菌体启动子(T7和SP6)，为RNA聚合酶的附着供应了特异性识别位点。加入T7或SP6 RNA聚合酶，所克隆的外源基因便会转录出相应的mRNA。 6、穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector） 由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载