天然多肽类化合物的分离与鉴定.docx

天然多肽类化合物的分离与鉴定 多媒体化合物广泛存在于自然界。天然产物中已知的活性多肽主要是由生物体分泌细胞、内分泌腺组织器官、体液或胞质中产生或获得的, 生命活动中的多种生理功能均与活性多肽密切相关。随着分离纯化技术和结构鉴定等研究方法的飞速发展, 越来越多的具有某种生物活性及药用价值的天然多肽类化合物被分离鉴定出来。本文将从多肽类物质的分离纯化和鉴定方法着手, 对近几年的色谱法、电泳、质谱及核磁共振等方法在多肽类物质研究中的最新应用进展作一综述。 1 常用的提取工艺 多肽类物质种类繁多, 实际的分离和纯化工作需要根据其各自不同的理化性质选择不同的纯化方法, 常用的包括冻融法、酶解法、盐析法、超滤法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、聚乙二醇沉淀法、凝胶过滤法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、疏水层析、逆流分溶等。这些方法常常组合到一起对特定的多肽进行分离纯化, 同时其中的一些方法也可用于多肽类物质的分析, 现举例如下: 1.1 色度法 1.1.1 反相高效液相色谱 高效液相色谱 (HPLC) 的出现不仅是药物研发领域的革命, 同时也为多肽类物质的分离提供了更有利的方法。在适宜的色谱条件下应用HPLC可以在短时间内完成对蛋白质、多肽的分离, 更重要的是HPLC能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。在多肽的分离、纯化和鉴定中应用最多的是反相高效液相色谱 (RP-HPLC) , 约95%是C18反相硅胶HPLC。其原理是基于多肽的疏水性, 在不同介质条件下, 使不同的多肽得以分离, 具有快速、高效和高回收的特点, 在分离和制备多肽及蛋白质上有独特的优越性。利用RP-HPLC分离多肽时, 首先要确定不同结构的多肽在柱上的保留情况。为了获得一系列的保留系数, Wilce等利用多线性回归方法对2 106种肽的保留性质与结构进行分析, 得出了不同氨基酸组成对保留系数影响的关系, 其中极性氨基酸残基在2~20氨基酸组成的肽中, 可减少在柱上的保留时间;在10~60氨基酸组成的肽中, 非极性氨基酸较多也可减少在柱上的保留时间, 而含5~25个氨基酸的小肽中, 非极性氨基酸增加可延长在柱上的保留时间。同时, 亦有文献报道了肽链长度、氨基酸组成、温度等条件对保留情况的影响, 并利用计算机处理分析得到每种多肽的分离提取的最佳条件。 1.1.2 层析或凝胶色谱 分子排阻色谱 (Sizs-Exclusion chromatography, SEC) 又称分子筛层析或凝胶色谱, 是利用多肽分子大小、形状差异来分离纯化多肽物质, 因此对分离一些较大聚集态分子十分方便。如人重组生长激素的分离, 不同结构、构型的生长激素 (GH) 在SEC柱上分离行为完全不同, 从而可分离不同构型或在氨基酸序列上有微小差异的变异体, 一些分子量较大的肽可利用此法进行分离分析。 1.1.3 活性多肽的分离纯化 离子交换色谱 (Iron-Exchange chromatography, IEXC) 是根据物质的带电性质及带电数量的不同而进行分离的一种层析技术, 同时也是活性多肽分离纯化过程中使用最广泛的色谱技术, 分为阳离子柱与阴离子柱两大类。在多肽类物质的分离分析研究中, 对多肽的性质、洗脱剂、洗脱条件的研究较多, 不同的多肽分离条件有所不同, 特别是洗脱剂的离子强度、盐浓度等对纯化影响较大。IEXC最适用于早期纯化阶段。一般情况下, 粗胶粒的离子交换剂用在提纯的前面步骤中, 高分辨率的离子交换剂则用在纯化的后面步骤中。 1.1.4 鸡中的小疏水作用 多肽中一般都含有疏水基团, 疏水色谱 (Hydrophobic interaction chromatography, HIC) 是利用多肽中含有的疏水基团可与固定相之间产生疏水作用而达到分离分析的目的, 与RP-HPLC相比, HIC具有较少使多肽变性的特点。 1.1.5 线性层析技术 高效置换色谱 (High-Performance Displacement Chromatography, HPDC) 利用一种非线性层析技术, 借助小分子高效置换剂来交换色谱柱上的样品, 从而达到分离的目的。它具有分离组分含量较少成分的特性, 与传统的洗脱层析技术相比有着明显优点, 即高上样量、高产率、高分辨率, 以及被分离样品在分离过程中的浓缩效应, 这一技术已越来越引起人们的关注。研究表明, 置换剂的相对分子质量越低, 越易于与固定相结合, 因此在分离相对分子质量小的多肽时, 需要更小的置换剂才能将其置换纯化出来。 1.2 分析与法 1.2.1 单抗类物质分离 亲和层析 (Affinity chromatography, AC) 是利用固定相配基与其特异性配体之间的特异亲和性而分离物质的层析方法。按照特异亲和作用分为抗原-抗体、酶-底物、凝