一种蛋白质水解液水解度测定方法的建立.docx

一种蛋白质水解液水解度测定方法的建立 大豆苷是在脱水后由瓜氨酸中断引起的短醇链的混合物。由于它的良好耐酒性和特殊的生理活性，已得到广泛研究。 现在大豆多肽的生产工艺主要是利用各种不同性质的蛋白酶作用于大豆蛋白将其水解成不同链长的短肽。由于只有由3~6个氨基酸残基组成的短肽链才具有独特的功能特性,因此在生产中,反映原料蛋白被水解程度的指标水解度(DH,Degree of Hydrlysis)的及时测定和实时控制便成为保证产品质量的关键。水解度通常的定义为: 常用的蛋白水解液水解度的测定方法有三种,详见表1。 本实验室目前进行的微生物水解法产大豆多肽的研究中,需即时准确的测定微生物发酵液中大豆蛋白在不同时间的水解度以控制产品品质,优化发酵工艺。常用的三种测定方法由于各自的局限性均不能达到本研究的要求。因此,我们根据水解度的定义,借鉴间接测定法的原理,建立了一种新的水解度测定法。以不同时间的大豆蛋白发酵液为样品,用新建立的方法和TCA沉淀法测定其水解度,并对两者结果进行比较,以探讨新方法测定水解度的可行性。 1 材料和方法 1.1 改良大豆蛋白、氨基酸标准液及三酮试剂 豆粕粉 市购低温脱脂豆粕,经凯氏定氮测定其大豆蛋白含量为43.7%;发酵菌种实验室保藏菌种,此菌能在发酵过程中产蛋白酶水解大豆蛋白;茚三酮显色液改良的茚三酮试剂-乙二醇并补加正丁醇和丙酮的茚三酮溶液这种试剂灵敏度高且稳定;氨基酸标准液:参见文献,此标准液每毫升含氮5μg,相当于含游离-NH20.36μmol/ml;10%(W/V)三氯乙酸(TCA);其它试剂均为分析纯。 1.2 材料和仪器 BS200电子天平 北京赛多利氏天平有限公司;818型p H计北京奥立龙有限公司;KDN-4B凯氏定氮仪上海新嘉电子有限公司;722S分光光度计上海精密科学仪器有限公司。 1.3 原料蛋白的肽键数测定 蛋白质或多肽水解时每断裂一个肽键(酰胺键)会同时释放出一个游离-NH2和一个游离-COOH,通过测定发酵液中新生成的游离氨基或游离羧基数可反映被水解的肽键数。同理,将原料蛋白以强酸彻底水解打断其所有肽键,新生成的游离氨基数(或羧基数)扣除水解前原有的游离氨基数(或羧基数),即为原料蛋白的总肽键数。被水解的肽键数与原料总肽键数的比值即为发酵液的水解度。 1.4 游离-nh2数法 Ah—不同时间发酵液中的总游离-NH2数(mmol); A0—原料蛋白中固有的游离-NH2数(mmol); A总—原料蛋白强酸水解后的总游离-NH2数(mmol)。 1.5 测量 N的测定 微量凯氏定氮法;游离-NH2的测定茚三酮显色法。 1.6 样品的制备和蒸发 不同时间发酵液的制备 以5%(W/V)豆粕粉为发酵原料,高温灭菌后接入发酵菌种,于30℃,120r/min条件下进行摇瓶发酵,分别于0、8、1 6、3 2、4 0、4 8 h取样,灭菌离心后取上清液备用。 原料蛋白完全水解液的制备 准确称取0.05g原料豆粕粉于水解管中,加入6N的盐酸10ml,在真空装置上安装水解管抽真空,待真空度达到后用喷灯密封水解管。于110℃恒温器中反应24h,水解完后,把水解管开封,用旋转蒸发仪去除盐酸。干涸后用蒸馏水溶解,并定容至100ml。 实验每组数据重复三次,每次取两个平行样。数据分析采用EXCEL软件。 2 结果与讨论 2.1 原料/蛋白总氮含量的测定 按体积比1:1分别于上述不同时间的发酵液中加入1 0%T CA,6 0℃水浴静置1 0 mi n后,5 00 0 r/m in离心1 5 mi n,取上清,其中沉淀物为水解未完全的蛋白质。微量凯氏定氮法测定上清液中的氮含量,此为酸溶性氮含量,乘以发酵液总体积100ml,换算成总酸溶性氮含量(即为TCA法公式中的Nh,其中0h的为N0)。 同时测定原料豆粕粉中氮含量,乘以原料总量5g,换算成原料总氮含量(即为T C A法公式中的N总),结果如表2。 从表中可看出随着发酵时间的延长,发酵液中的酸溶性氮含量增加,即未被水解的蛋白质含量在减少,表明水解程度在深入。 2.2 加标回归方程 在一系列干试管中,分别加入氨基酸标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.4、1.6m l,按文献进行茚三酮显色反应后在580nm下比色测定光密度,并绘标准曲线,见下图。 此标准曲线回归方程为y=2.1331x+0.0144,R2=0.999。其横坐标为反应体系中的-NH2含量(μmol),纵坐标为相应吸光度。 2.3 原料蛋白完全水解液的三酮显色结果 取不同时间发酵液稀释100倍后各取1ml进行茚三酮显色。测出吸光值后根据标准曲线查其-NH2含量,乘以稀释倍数后计算发酵液中总-NH2含量。 取原料蛋白完全水解液适当稀释后进行茚三酮显色,查标准曲线计算其总-NH2含量。结果见表